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杂志：Cell IF: 36.216 摘要：尽管克隆性新抗原负荷与免疫治疗反应的改善有关，但其功能基础尚不清楚。我们在一个新的小鼠黑色素瘤模型中研究这个问题，这个模型使我们能够探索肿瘤内异质性（ITH）对肿瘤侵袭性和免疫性的影响，而不依赖于肿瘤突变负荷。UVB衍生的突变诱导产生高度侵袭性肿瘤，抗肿瘤活性降低。然而，ITH降低的单细胞源性肿瘤很快被排斥。它们的排斥反应伴随着T细胞反应性的增强和一个较弱的抑制性微环境。利用系统发育分析和单细胞克隆混合实验，分析了肿瘤形成的克隆数及其克隆多样性。我们对黑色素瘤患者肿瘤数据的分析总结了我们在整体生存率和免疫检查点治疗反应方面的结果。这些发现强调了克隆突变在强有力的免疫监测中的重要性，以及量化患者ITH以确定对检查点阻断的反应的必要性。  Highlights 新的小鼠系统解绑了肿瘤的突变负荷和肿瘤的异质性。 因为免疫排斥，较低的肿瘤异质性导致肿瘤生长的减慢。 克隆数目及其遗传多样性都介导肿瘤的生长和排斥反应。 肿瘤异质性与患者生存和检查点阻断反应有关。  图1. TCGA皮肤黑色素瘤样本中ITH、突变负荷和患者生存率的相关性分析 （1a）高突变负荷与低突变负荷患者的kaplan-meier生存曲线（时间以x轴上的天数为单位）。对数秩统计：1.96，P=0.16。 （1b）高与低CNV负荷患者的kaplan-meier生存曲线。对数秩统计：0.31，P=0.577。 （1c）高与低ITH患者的kaplan-meier生存曲线。对数秩统计：3.97，P=0.046。 （1d）按克隆数分离的患者的kaplan-meier生存曲线。 （1e）根据突变负荷和ITH的组合分离的患者的kaplan-meier生存曲线。对数秩统计：9.2，P=0.0267。 （1f）根据CNV负荷和ITH的组合分离的患者的kaplan-meier生存曲线。对数秩统计：4.57，P=0.206。 （1g）ITH高与低患者的CYT评分（对数表）。***P<0.001，威尔科克森试验。 （1h）按克隆数分离的患者的CYT评分（对数表）。斯皮尔曼rho:0.27，p<0.001。  图2. 差异异质性诱导体内肿瘤差异生长 （2a）产生UVB照射细胞和产生从UVB照射细胞衍生的SCC的实验设计方案。UVB以600J/m2的剂量照射细胞系，从这些细胞中产生SCC。 （2b）亲代B2905细胞（黑色）、紫外线照射B2905细胞（红色）、SCC 1（紫色）和SCC 2（绿色）等位基因变异频率（VAF）在log2空间的分布。VAF>0.25（log2=-2）被认为是克隆的。 （2c）接种后第15天，从接种亲本或UVB照射细胞系的小鼠身上切除肿瘤。 （2d）接种亲本B2905细胞（黑色）和紫外线照射细胞（红色）的小鼠体内肿瘤生长。n=34；数据代表三个独立实验。数据为平均扫描电镜。 （2e）从UVB照射的b2905细胞中切除的肿瘤与SCC 2相比，第19天。 （2f）接种UVB（红色）或SCC1（紫色）和SCC 2（绿色）的小鼠体内肿瘤生长。n=45。  图3. 异质性降低与抗肿瘤免疫反应增强相关 （3a）接种紫外线照射的B2905细胞系（红色，n=5）或20种不同来源于该系的SCC（SCC 3 22，黑色，n=3）的小鼠体内肿瘤生长。 （3b）体内进化实验。所示为UVB照射的b2905细胞系的VAF图，由接种后第7、9、13和17天采集的肿瘤样本的WES数据生成。数据是两个生物重复的代表。 （3c）左：第二代细胞系及其衍生物SCCs的产生方案。右图：用紫外线照射的B2905二级细胞株（红色，n=5）或5种不同的SCC（绿色，n=5）接种小鼠体内肿瘤生长。 （3d）接种紫外线照射的B2905细胞系（红色，n=3）或来源于该细胞系的SCC（SCC 1，紫色，n=4；SCC 2，绿色，n=3）或亲代B2905细胞（黑色，n=3）的NSG免疫受损小鼠体内肿瘤生长。  图4. 同源SCCs引起强烈的免疫反应 （4a）流式细胞术分析第19天总TCRβ+TILs中颗粒酶B和CD107a+的数量。n=45。 （4b）流式细胞术分析第19天总TILs中干扰素ϒ（IFN-ϒ）。n=45。 （4c）CYT评分来自UVB照射b2905和SCC 2肿瘤的cd8+TIL的RNA序列数据。 （4d）图3c中CYT评分与肿瘤重量之间的Pearson相关性。 （4e）所示肿瘤中总CD8+TILs的数量。每个肿瘤4个切片，每个细胞系3个肿瘤。亲本细胞与SCC 2之间差异显著，而亲本细胞与UVB之间差异不显著。 （4f）肿瘤核心中CD8+TILs平均百分比相对于（e）所述肿瘤边缘的相对数量。 （4g）细胞接种后第10天，来自亲本、UVB和SCC2肿瘤的载玻片中CD8的代表性免疫组化染色。比例尺代表100毫米。 （4h）细胞接种后10-11天，B2905亲本、UVB和SCC 2、16和11肿瘤中cd3和Foxp3的免疫荧光染色。检查每个肿瘤的3-4个切片和来自每个细胞系的两个肿瘤。比例尺代表200毫米。 （4i）相对定量（4h）中所述的CD3+TILs中Foxp3+的百分比。  图5. SCCs中HLA结合新抗原的检测与鉴定 （5a）左：靶向质谱法检测的三种代表性新抗原的光谱。这些新抗原被检测到的SCC被指出。右图：用流式细胞仪检测0.1100mm多肽孵育18h的RMA-S细胞表面H2-Db和H2-Kb的表达。 （5b）用DC疫苗免疫（5a）中所述的三种新抗原的小鼠的体内杀灭试验。杀灭率是相对于未接种疫苗的未接种过疫苗的小鼠所测得的杀灭率来计算的。  (6a) 紫外辐射B2905细胞系的系统发育树图。该树描述了突变聚类分析的结果，用于定义UVB细胞系中存在的不同的亚克隆。展示了亚克隆之间的系统发育关系，并将20个UVB衍生的SCCs分别映射到遗传相似性最高的亚克隆分支上。20个SCC中的每一个都被描绘成一个由100个肿瘤细胞组成的球，颜色编码反映了每个SCC样本中每个分支的百分比频率。右上角的方框显示的是UVB亲代样本，同样显示为一个由100个肿瘤细胞组成的球，颜色编码与亚克隆分支相匹配。 (6b) 顶部:接种的四种3AB混合疫苗的维恩图，表示每种混合疫苗中蛋白编码突变的数量和SCC之间的交点。底:四种不同的3AB混合的体内肿瘤生长曲线。n = 5。数据均为平均SEM。 （6c）左：6WB混合物（在TB-4内）和6AB混合物（每个TB一个SCC）的体内肿瘤生长曲线。n=45。右图：12WB混合物（TB-5内）和12AB混合物（每个TB两个SCC）和UVB照射的B2905细胞系的体内肿瘤生长曲线。n=56。数据为平均扫描电镜。 （6d）在（5c）中描述的混合物中克隆突变与亚克隆突变的百分比。 （6e）包括在（5b）和（5c）中所述的每种混合物中的SCC。 （6f）40天内6AB、6AB、12AB和12WB混合突变数（唯一）与最大肿瘤体积大小（立方厘米）之间的关系。每个点代表一个单独的鼠标。图中显示了6和12个混合体之间的统计显著性，但不显示突变数和肿瘤体积之间的统计显著性（wilcoxon秩和检验）。  图7. 免疫检查点抑制剂数据集的shannon多样性指数分析 (7a) 这幅漫画展示了SDI的两个例子，顶部低的SDI(肿瘤主要由一个主克隆组成)和底部高的SDI(肿瘤由多个克隆组成，克隆之间的均匀度更高)。 SDI是用单个肿瘤积累(从Pyclone集群)类型和体细胞突变为实体,这样肿瘤低SDI将几乎所有的突变集中在一个克隆,而且,相比之下,一个肿瘤高SDI会更多的克隆,在每个克隆突变均匀和多样化。 (7b) SDI分析应用于Snyder等人(2014)的反ctla4数据集。 总体生存率Kaplan-Meier图显示了SDI高(队列中SDI高于中值)和SDI低(队列中SDI高于中值)的患者。 时间点有危险的患者人数如下表所示。P=0.0064 （7c-7e）与（7b）中RIAZ等人的数据格式相同。（2017）αPD-1数据集（7c） P=0.079 ，Hugo等人（2016）反PD-1数据集（7d） P=0.096，和Van Allen等人（2015）反CTLA4数据集（7d）。 （7f） 森林图，显示每个数据集中SDI的HR，HR值与SDI中每单位增加（即每增加+1）的生存风险相对应。为了进行显著性分析，使用Cox比例风险模型（不包括其他临床预测因素，如分期）将SDI作为一个连续变量进行测试（以显示整个数据范围内的连续关联）。 总而言之，通过一系列体内实验以及系统分析，研究者们发现在黑色素瘤中，相比其他因素（突变负荷、CNV），肿瘤内的异质性对肿瘤生长起到了更为决定性的作用。至于为什么异质性高的肿瘤会抑制免疫反应，一种可能是因为在异质性高的肿瘤内，亚克隆上的新生抗原被稀释了，不足以引起击退肿瘤生长的免疫反应。 About us： 格源致善是一家以个性化肿瘤疫苗的研究和应用为核心的生物医学科研公司，始终聚焦于个性化肿瘤疫苗的临床治疗研究、新抗原预测和标准化评估体系的建立。 |
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