【原】微生物多样研究—16S rRNA基因功能代谢预测

1. 16S rRNA基因功能代谢预测

• 对于微生物生态学研究，我们最关注的无疑是菌群所具备的代谢功能。随着数据分析技术的发展，我们现在已能根据已知的微生物基因组数据，对菌群组成的测序数据（典型的如16SrRNA基因的测序结果）进行菌群代谢功能的预测，从而把物种的“身份” 和它们的“功能”对应起来。  

• 根据菌群代谢功能预测结果，一方面能一窥菌群功能谱的概貌，发挥菌群多样性组成谱测序性价比高的优势；另一方面也能帮助指导后续宏基因组Denovo鸟枪法测序的实验设计，更合理地筛选用于后续研究的样本。

2.  PICRUSt功能预测分析

PICRUSt（PhylogeneticInvestigation of Communities by Reconstruction of Unobserved States）是由美国哈佛大学的CurtisHuttenhower课题组开发的菌群代谢功能预测工具，通过将现有的16SrRNA基因测序数据与代谢功能已知的微生物参考基因组数据库相对比，从而实现对细菌和古菌代谢功能的预测；预测过程中还考虑了不同物种16SrRNA基因拷贝数的差异，并对原始数据中的物种丰度数据进行校正，使预测结果更准确可靠。

分析的总体思路如下：

• 先根据已测微生物基因组的16SrRNA基因全长序列，推断它们的共同祖先的基因功能谱；

• 对Greengenes 16SrRNA基因全长序列数据库中其它未测物种的基因功能谱进行推断，构建古菌和细菌域全谱系的基因功能预测谱；

• 将测序得到的16S rRNA基因序列数据与Greengenes数据库比对，寻找每一条测序序列的“参考序列最近邻居”，并归为参考OTU；

• 根据“参考序列最近邻居”的rRNA基因拷贝数，对获得的OTU丰度矩阵进行校正；

• 最后，将菌群组成数据“映射”到已知的基因功能谱数据库中，实现对菌群代谢功能的预测。

PICRUSt能将16SrRNA基因序列在3种功能谱数据库中进行预测，即KEGG、COG和Rfam。

KEGG数据库的核心为生物代谢通路分析数据库（KEGG PATHWAY Database，http://www./kegg/pathway.html），其中将代谢通路归为6大类：

• 代谢（Metabolism）

• 遗传信息处理（Genetic Information Processing）

• 环境信息处理（Environmental InformationProcessing）

• 细胞进程（Cellular Processes）

• 生物体系统（Organismal Systems）

• 人类疾病（Human Diseases）

每一类代谢通路又被进一步划分为多个等级。目前，第二等级一共包括45种代谢通路子功能，第三等级即对应代谢通路图，而第四等级则对应代谢通路上各个KO（KEGGorthologous groups，KEGG直系同源基因簇）的具体注释信息。

COG（Clustersof Orthologous Groups，https://www.ncbi.nlm./COG/）数据库是由NCBI维护的直系同源基因数据库，是指不同个体中由于物种形成（Speciation）的进化历程而产生的的同源基因，这些基因来源于共同祖先；因此，在进化历程中，直系同源基因通常都保留了相同或相似的功能特性。

根据PICRUSt的预测结果，可以获得每样本对应于各功能谱数据库的注释信息，以及预测得到的功能类群的丰度矩阵。

KEGG功能预测：

通过OTU聚类分析，得到的OTU代表序列与Greengenes数据库比对，得到KEGGpathway 3个层级和丰度表。

COG功能预测：

通过OTU聚类分析，得到的OTU代表序列与Greengenes数据库比对，得到COG orthology和function丰度表。

利用丰度表信息完成各类可视化结果展示。