长期的身体或精神压力会增加抑郁和焦虑的风险，还会导致外周 T 淋巴细胞的功能障碍，但是 T 淋巴细胞在情绪失调中的病理作用和调控机制并不清楚。目前，治疗焦虑或抑郁的药物大多直接靶向中枢神经系统，副作用很大。因此，阐明焦虑、抑郁等疾病的发病机制对药物的开发意义重大。本研究通过转录组、单细胞转录组、代谢组等多种技术手段，揭示了 CD4+ T 细胞嘌呤合成代谢紊乱与慢性压力诱导的焦虑行为之间的重要联系。其中代谢组学部分由诺禾致源完成。1. CD4+ T 细胞在压力诱导焦虑的过程中发挥关键作用
研究首先通过对野生型（WT）小鼠或T细胞、B细胞缺陷的 Rag1-/- 小鼠进行连续足底电击（ES），建立焦虑模型。旷场实验观察到WT小鼠表现出焦虑行为，Rag1-/- 小鼠则否；抗体中和去除 CD4+ T/CD8+ T 细胞，发现只有去除 CD4+ T 细胞才能显著恢复 ES 诱导的焦虑行为；同时发现 CD4+ T 细胞缺失能够阻止急性束缚应激（RS）小鼠发展为焦虑症，表明 CD4+ T 细胞对压力诱导的焦虑症具有广泛的影响。此外，作者还发现，焦虑小鼠的 CD4+ T 细胞保留了焦虑印迹，可使 Rag1-/- 小鼠在无压力刺激时表现出焦虑行为；并且，CD4+ T 细胞引发焦虑行为并不依赖于其活化状态。2. 压力导致外周 CD4+ T 细胞线粒体碎裂进而引发焦虑转录组学分析发现，ES 刺激的 CD4+ T 细胞与正常相比，差异表达基因（DEGs）大部分为编码线粒体蛋白的基因（图 1 B-D），并且糖酵解和氧化磷酸化水平降低（图 1E、F）。同时，在显微镜下观察到 ES 处理的CD4+ T细胞中呈现点状线粒体或严重的线粒体碎裂（图 1G），介导线粒体融合的蛋白（MFN2、MIGA2）表达下调进一步证实了该结果（图 1H），表明压力刺激 CD4+ T 细胞会导致线粒体形态异常和代谢功能障碍。研究还建立了 Miga2-/- 基因敲除小鼠模型，观察到 CD4+ T 细胞中高度破碎的线粒体，这些小鼠表现为严重的抑郁症状，进一步实验证实焦虑行为是线粒体碎裂引起的，并非 CD4+ T 细胞中蛋白的特殊功能造成。有研究表明抑郁动物脑部的花生四烯酸（AA）升高，AA通过其代谢产物白三烯 B4 (LTB4)和前列腺素(PG) E2 作用于外周淋巴细胞，LC-MS 代谢组学检测结果证实LTB4、PGB1 等物质确有增加（图 1I）。其中，LTB4 可引起严重的焦虑行为（图 1J），体外能显著促进线粒体碎裂（图 1K）以及原代 CD4+ T 细胞中 MFN2、MIGA2 表达下调（图 1L）。 图1 压力引起 CD4+ T 细胞代谢紊乱和线粒体碎裂
3. T 细胞线粒体持续裂变导致嘌呤代谢紊乱 对非靶向代谢组数据进行 PLS-DA 分析，发现 Miga2 T 细胞敲除（Miga2TKO）的焦虑小鼠与 WT 小鼠代谢谱差异显著（图 2A）。聚类分析和 KEGG 通路富集结果显示Miga2TKO 小鼠与 WT 小鼠的差异代谢物主要富集于嘌呤代谢（图 2B、4C），其中腺嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤在 Miga2TKO 中的含量是 WT 中的10-100倍（图 2D），去除 CD4+ T 细胞的 Miga2TKO 小鼠血清中黄嘌呤浓度明显降低（图4E），同时临床数据表明焦虑症患者血清中黄嘌呤水平明显升高（图 2F）。对 WT 小鼠腹腔注射合成的黄嘌呤和腺苷，结果发现均可引发焦虑行为（图 2H），而当黄嘌呤和腺嘌呤都存在时，黄嘌呤发挥主导作用。BCX-1777（一种嘌呤代谢抑制剂）治疗能够显著降低Miga2TKO 和 ES 小鼠的焦虑症状并降低其血清中的黄嘌呤水平（图 2I、4J）。表明，病理性 CD4+ T 细胞中高水平的黄嘌呤在焦虑发生中起到关键作用。
图2 CD4+ T 细胞线粒体紊乱导致血清嘌呤合成增加 以往研究表明，杏仁核对产生恐惧和焦虑起着关键作用。本研究结果显示，Miga2TKO小鼠或者黄嘌呤处理的 WT 小鼠的左侧杏仁核明显更大，非神经元细胞数更多（图 3A）。10X Genomics 单细胞转录组测序进一步发现，Miga2-/-小鼠中少突胶质细胞异常增多，去除 CD4+ T 细胞可恢复（图3G）；当少突胶质细胞缺少嘌呤受体A1（Adora1），Miga2-/- 小鼠不再出现焦虑症状。另外，KEGG 分析显示少突胶质细胞的差异蛋白主要富集于嘌呤代谢和有丝分裂细胞周期；BrdU 检测进一步证实，黄嘌呤直接引起了少突胶质细胞的增殖。结论表明，Miga 2-/- T 细胞产生过量的黄嘌呤，通过 A1 受体作用于左侧杏仁核的少突胶质细胞，促进焦虑行为。
图3 CD4 + T 细胞来源的黄嘌呤通过 AdorA1 作用于杏仁核的少突胶质细胞 5. CD4+ T 细胞线粒体碎裂导致 IRF-1 累积，促进黄嘌呤从头合成CD4+ T 细胞如何产生黄嘌呤？研究发现，Miga2-/- 小鼠的 CD4+ T 细胞中糖酵解和氧化磷酸化活性降低（图 4A），嘌呤合成所需的分子（如腺苷脱氨酶 Ada、嘌呤核苷磷酸化酶 Pnp2 和黄嘌呤氧化酶/黄嘌呤脱氢酶Xdh）增加（图4D、G）。同时发现干扰素调节因子1（IRF-1）显著累积，富集于 Ada、Xdh 和 Pnp2 转录起始位点（TSS）的特定结合位点，促进嘌呤合成；而去除 IRF-1 后 Miga2TKO 小鼠的焦虑行为恢复。13C 标记的代谢流分析显示 Miga2 缺陷的 CD4+ T 细胞糖酵解水平较低，但核酮糖-5-磷酸（R-5-P）、CAIR、腺苷和肌苷产生增多（图4B、C），表明线粒体从融合到裂变，葡萄糖进入了磷酸戊糖途径用于嘌呤的从头合成，而 CD4+ T 细胞来源的黄嘌呤直接引发了焦虑。
图 4 线粒体碎裂促进 CD4+ T 细胞中黄嘌呤从头合成 本研究通过对焦虑小鼠进行转录组、代谢组等分析，揭示了外周 CD4+ T 细胞来源的黄嘌呤与焦虑行为的关系：压力导致外周 CD4+ T 细胞的线粒体碎裂，干扰素调节因子 IRF-1 累积，结合在嘌呤合成所需分子的转录起始位点，促进黄嘌呤的从头合成，过量的黄嘌呤通过嘌呤受体 A1 作用于左侧杏仁核的少突胶质细胞，从而引发焦虑行为。该研究加深了适应性免疫与神经发育、神经精神障碍之间关系的理解，对阐明焦虑症发病机制及新治疗药物的开发具有深远意义。
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