mTORC1蛋白复合体能够感知多种环境信息如营养、生长因子、氧气、能量等，整合后调控机体生长。mTORC1信号失调与癌症、神经系统疾病等多种疾病相关。营养成分如氨基酸、葡萄糖、胆固醇等通过信号转导招募mTORC1从胞质转移到溶酶体膜，位于溶酶体膜上的异二聚体Rag GTPase和mTORC1结合并激活mTORC1信号通路。mTORC1由核心mTOR、Raptor和mLST8亚单位组成，Raptor和Rag GTPase-Ragulator复合体直接作用。Ragulator含有5个亚单位，将Rag GTPases固定在溶酶体膜。Rag GTPases通过C端roadblock结构域相互作用形成异二聚体，即RagA或RagB与RagC或RagD相互结合。营养成分能够促进失活态”RagAGDP：RagCGTP转变为“激活态”RagAGTP：RagCGDP (RagB::RagD需要同样GTP/GDP的转换)。只有RagA/B·GTP–RagC/D·GDP这一种复合物状态能招募mTORC1到溶酶体膜上【1】。GAP蛋白复合物能够部分调控Rag GTPases的活化状态。当氨基酸浓度较低时，GATOR1促进RagA或B的GTP水解；Folliculin（FLCN）和FNIP1或FNIP2形成复合物介导RagC或D的GTP水解【2】。Rag的GTPase结构域含有二级结构网络—switches，当GDP/GTP相互转换或水解时switches发生构象变化【3】。尽管Rag二聚体有4种核苷酸组合，但只有RagA/BGTP：RagC/DGDP能够和m TORC1相互作用，对营养成分发生响应。目前，我们对FLCN：FNIP1/2复合物在溶酶体上定位以及该定位如何与Rag发生作用；为什么只有RagA/BGTP：RagC/DGDP是激活态，能够和mTORC1发生作用都尚未清楚。 近日，Science杂志先后在线发表了两篇文章从结构学角度对mTORC1激活过程机制进行报道，Structural basis for the docking of mTORC1 on the lysosomal surface和Structural mechanism of a Rag GTPase activation checkpoint by the lysosomal folliculin complex，揭示了RagA/BGTP：RagC/DGDP处于激活态的结构基础，并从结构角度解释了FLCN：FNIP1/2和Rag相互作用的机制。这两项研究分别来自mTOR领域顶尖的David Sabtini和Robert Zoncu（曾经是Sabtini组的博后）实验室。11月5日，Cell又在线发表Sabtini实验室和Zhiheng Yu实验室的联合研究成果：Cryo-EM structure of the human FLCN-FNIP2-Rag-Ragulator complex. 其中第一篇来自美国麻省理工David M. Sabatini的研究，利用HEK-293中表达人源Raptor蛋白，细菌表达RagA-RagC二聚体和Ragulator五聚体，并在RagC中引入突变稳定RagC的GDP结合状态以固定Rag GTPases和Raptor的相互作用。然后体外重组这一超大复合物，经冷冻电镜技术进行解析得到分辨率为3.18Ao的Raptor-Rag-Ragulator复合体结构。整体结构为细长条状，Raptor、Rag-Ragulator各自构成了一半，位置彼此平行。Raptor的中心位置和Rag GTPase结合，而N端RNC结构域和C端WD40结构域则与Rag GTPase没有接触；Ragulator和Rags的CRD结构域有广泛的作用，但和Raptor没有直接的相互作用。Raptor中有3个α螺旋（α24、α26、α29）和RagA的switch I界面直接结合，形成氢键和盐桥。突变试验显示，3个螺旋对两者的结合都是必需的，其中α26起主要作用；位于RagA的switch I结构的突变虽然能够和RagC形成二聚体并和Ragulator结合，但是不能和Raptor结合。 通过分析氨基酸骨架的密度，研究人员发现了Raptor的一个新的结构“Raptor claw钳结构”：一个22-氨基酸环，根据RagC的核苷酸状态可能进入Rags构成的空间，并与RagA、RagC形成相互作用，其残基E935和RagC装载的GDP位置非常靠近，能够形成氢键作用。进一步分析显示，GTP的装载导致RagC/D switch I僵化，进而残基Ser86、Asn88和Raptor的钳结构发生碰撞；而且GDP到GTP的转换过程中，RagC的switch结构发生位移。相对的是，RagC-GDP的结构中，4个反向平行的β片层和2的底面α螺旋构成CRD口袋，而β2-β3环的Ser108和Phe109就位于CRD口袋侧面。GTP的装载导致β2-β3环和CDR口袋发生冲突，switch间的环路被迫改变位置，与CRD口袋有更大区域的结合，从而导致整个GTPase结构域重新定位，更加接近Rag异二聚体的中心轴。同时，RagAGTP：RagCGTP导致2个GTPase结构域的空间关闭，RagA（GDP-GTP）、RagC（GTP-GDP）则导致向侧面移动，而（GDP-GDP）则空间变宽。所以，Raptor的钳结构可以用于检测Rag异二聚体的核苷酸结合状态。Raptor首先短暂结合到RagA-GTP上，与switch I区域形成相互作用，与RagC的CRD有弱作用力。Rags的GTPase结构域和Raptor的钳结构相互作用，形成更加稳定的结合。只有当RagC装载了GDP并且switch I发生位移后，钳结构才能够彻底结合。这就解释了RagC只有装载了GDP才能够和Raptor作用。此外，Rag-Ragulator复合物与mTORC1的顶部和侧面接合，将mTORC1固定在溶酶体上。RagA/B和Raptor对于将mTORC1固定在溶酶体上，并激活mTORC1信号是必需的。第二篇是来自加州大学伯克利分校的James H. Hurley 和Roberto Zoncu的合作研究，对FLCN如何作用于RagC发挥GAP酶活性进行了结构学解析。研究人员首先发现只有RagAGDP：RagCXTP（突变RagC使其特异性结合黄苷酸）-Ragulator能够抑制FLCN：FNIP2的GAP活性，而且Ragularor将整个复合物定位到溶酶体上，两者能够稳定形成复合物，即LFC复合物——位于溶酶体膜的FLCN复合物（FLCN-FNIP2-RagAGDP：RagCGTP GTPases-Ragulator）。使用冷冻电镜技术，得到分辨率为3.6A的结构。复合物为细长条状，Ragulator和FLCN的DENN结构域处于复合物的两端。FLCN：FNIP2的2个longin结构域形成二聚体，是唯一直接和Rag的G结构域相互作用的元件。同时，FLCN能够催化核苷酸水解，促进RagC激活。结构表明FLCN：FNIP2不能和激活态的Rag-Ragulator形成稳定复合物，激活态Rag-Ragulator的G结构域发生重新定向。这种位置的改变使得RagA和RagC的G结构域之间的裂缝在非活动（RagAGDP：RagCGTP）状态下的宽度几乎是活动（RagAGTP：RagCGDP）状态下的2倍，而只有裂缝打开时，FLCN：FNIP2的longin二聚体才能结合RagA：RagC。复合物中，FLCN：FNIP2和RagA的作用更加广泛，突变FLCN中与RagA发生相互作用的残基则破坏LFC的形成，FLCN则不能定位于溶酶体膜上，而且Ragulator不能抑制FLCN：FNIP2的GAP活性。进一步研究表明，其他小GTPase能够自发进行核苷酸交换，但LFC的形成抑制RagA自发交换核苷酸的能力。LFC复合物中，FLCN：FNIP2和RagC相互作用的界面缺乏GAP催化的“arginine finger”。此外，FLCN的RagC-GAP活性能够感知营养成分的输入，调控MiT/TFE的核定位，从而控制溶酶体的生成和自噬发生。 第三篇发表于Cell的文章来自于Sabtini和Zhiheng Yu实验室，解析了人源FLCN-FNIP2-Rag-Ragulator复合物结构。该复合物和Zoncu实验室的文章一样，在线时间晚了一周。如下图所示，整体结构和Zoncu的相似。作者还发现了第164位Arg决定了FLCN的GAP活性。 总的来说，三项研究同时聚焦mTORC1通路，分别从结构的角度解释了Raptor如何识别Rag的核苷酸状态和FLCN如何定位于溶酶体并且其GAP活性如何被抑制的，为理解mTORC1信号的激活过程提供基础。Sabtini和Zoncu跨界做了结构研究得益于冷冻电镜技术和三维重构分析的长足发展。当年程亦凡老师实验室的博士博士后提前两年甚至三年被各大学校提前预定，冷冻电镜结构解析方兴未艾，将继续为我们提供更多大分子的信息。mTOR领域尚还有众多复合物结构等待揭示，比如AMPK-AXIN-LKB1和Ragulator、vATPase的结合和构象变化。
