|
Seahorse细胞能量代谢分析仪是检测线粒体功能和细胞代谢的有力工具，在代谢研究中广泛使用。因为其检测过程中用到了一系列氧化磷酸化和电子传递抑制剂，也涉及到糖酵解、氧化磷酸化等不同代谢途径，所以了解其基本原理和分析方法对理论学习和科研实践都很有帮助。  Seahorse XFe96 Seahorse检测时将细胞培养在专用的微孔板上，实时检测加入不同药物后的耗氧率（O2 consumption rate，OCR）和胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR），来表征细胞的代谢状况。其中OCR由线粒体电子传递造成，ECAR则源自乳酸发酵（糖酵解酸化）和线粒体产生的二氧化碳（线粒体酸化）。 OCR用来研究线粒体氧化磷酸化功能。检测时一般先测定正常状态下的基础呼吸（basal respiration），然后加入寡霉素（oligomycin）抑制ATP合酶，这是OCR显著下降，仅余下质子渗漏（proton leak）造成的耗氧率。降低部分即为氧化磷酸化的耗氧率（ATP production）。  OCR曲线，引自agilent.com 加入解偶联剂FCCP后，电子传递失去质子梯度的约束，就会以最大速率进行。所以OCR急剧升高，达到最大耗氧量（maximal respiration）。此值与基础呼吸之差，称为呼吸潜力（spare respiratory capacity）。最后加入电子传递抑制剂，如抗霉素A（antimycin A），完全抑制电子传递，耗氧率降至最低。 ECAR经常用来研究糖酵解等代谢状况。加入葡萄糖之前的基础值是非酵解产酸，如线粒体呼吸产生的二氧化碳造成的线粒体酸化。之后加入葡萄糖，升高的值就代表糖酵解。  ECAR曲线，引自agilent.com 加入寡霉素后，因为氧化磷酸化被抑制，细胞被迫完全采用乳酸发酵供能，所以产酸增加。此时的值称为酵解容量（glycolytic capacity），与糖酵解之差称为酵解储备（glycolytic reserve）。最后加入的2-DG（2-脱氧葡萄糖），是己糖激酶的竞争性抑制剂，可以阻断糖酵解，所以加入后曲线应该回归基础值。 不过，直接用ECAR测定糖酵解会有一些偏差。因为加入葡萄糖后，不仅糖酵解增强，氧化磷酸化也会增强。这将导致线粒体酸化增加，使计算出的糖酵解量偏高。  糖酵解酸化和线粒体酸化，引自agilent.com 所以安捷伦公司开发了新的试剂盒，同时测定OCR和ECAR，通过耗氧量计算出二氧化碳产量。扣除线粒体酸化后，得到的值称为糖酵解质子外排率（glycoPER），可以与细胞外乳酸积累速率呈 1:1 相关。所以glycoPER可以与其它测定结果相互比较。  glycoPER与细胞外乳酸积累速率呈 1:1 相关，引自agilent.com |
|
|
