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摘要：自噬是目前生物医学领域研究热点之一，广泛参与各种生理和病理过程。既往对自噬的研究多以自噬体的多少评价自噬水平的强弱，新近发现自噬体的增加并不能从本质上反映自噬的水平，仅仅能够反映自噬的诱导，或者自噬体清除的抑制。因为从自噬流的角度来看，自噬体的数量受形成和清除两方面影响，准确全面地评估自噬不仅包括自噬体的检测，还包括动态观察整个自噬流的过程是否通畅。我们提倡结合使用多种自噬检测方法以获取可靠数据，将动态和静态检测方法结合，更能有效说明细胞自噬的发生以及自噬流的变化。 关键词：自噬；自噬流；透射电子显微镜 New Trends in Autophagy Research-Autophagy Flow MA Pei-ze1，SUN Zheng-xin2，JIANG Yue-hua3 （1.Weihai Hospital of Traditional Chinese Medicine，Weihai 264200，Shandong，China；2.Maternal and child health care hospital of Huancui District，Weihai 264200，Shandong，China；3.Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250001，Shandong，China） Abstract：Autophagy is one of the hot topics in biomedical research.Which is widely involved in various physiological and pathological processes.Previous studies on autophagy have evaluated the level of autophagosome，and recently found that the increase of autophagosome can not reflect the level of autophagy in nature.It can only reflect the induction of autophagy and the inhibition of autophagosome.From the point of autophagy flux，the number of the autophagosome is affected by the formation and removal of the two aspects，accurate and comprehensive assessment of autophagy not only includes the detection of the body，but also includes the dynamic observation of the entire flux ofautophagy is smooth.We promote the combination of dynamic and static detection methods to obtain reliable data，which can effectively explain the occurrence of autophagy and the changes of autophagy flux. Key words：Autophagy；autophagy flux；Transmission electron microscope 目前，细胞自噬已经成为继凋亡之后生物医学最热门的研究领域之一，越来越多的研究表明自噬可能与心血管疾病、肿瘤以及神经退行性变等多种病理生理过程密切相关[1]。随着研究的深入对自噬的检测也提出了更高的要求，许多学者，尤其是刚刚进入这一领域的研究者们迫切想要掌握研究自噬的关键是什么，遗憾的是在自噬的研究过程当中，并没有一个绝对的研究准则适于所有的实验内容供学者遵循，因为有些常用自噬检测方法在某些细胞、组织或器官中并不合适，甚至是存在问题的[2-5]。这就需要我们重新认识自噬，找到客观的方法评价自噬。 自噬是一个高度动态、多步骤的生物过程，在许多环节可以被调控，大致可以分为四个部分：自噬膜（sequestering phagophore）、自噬体（autophagosome）、自噬内涵体（amphisome）以及自噬溶酶体（autolysosome），其中自噬体与内涵体结合形成自噬内涵体，自噬内涵体或自噬体与溶酶体结合形成自噬溶酶体[6-8]。现有的大部分文献都是通过检测自噬体的数量来评价自噬水平，基于上述流程我们可以发现通过电镜等手段检测到的自噬体的积累，既可以反映自噬的诱导，也可以反映自噬体的消耗减少，例如，内涵体或溶酶体低效率的融合，影响到整个底物运输过程，会抑制自噬体向自噬内涵体或自噬溶酶体的成熟转化，当然自噬底物降解速率的减慢也会导致整个自噬流程的减弱，从而出现自噬体的蓄积。如何正确评价自噬情况就需要我们区分通常情况下自噬体短暂的蓄积是因为诱导导致的，还是自噬完成的效率低下导致的。既要静态检测自噬体水平，也需要我们动态监测自噬底物来证实底物到达了溶酶体，并且在合适的时间被降解，以及自噬对细胞成分降解率的变化。这就提出了一个新的概念―自噬流，自噬流的含义包含了整个自噬过程，包括了自噬结构的形成，底物向溶酶体的运送（通过溶酶体与自噬体或者自噬内涵体的融合），以及底物的降解和大分子物质释放回细胞质的整个流程。本文就有关自噬流的检测做一简单介绍，并对各种检测方法作出评价。 1 透射电子显微镜进行形态学观察 透射电子显微镜是从形态学上观察自噬现象最直接，最经典的方法，可以用于监测选择性和非选择性自噬，能够定性定量检测自噬过程中各种结构，包括吞噬泡、自噬体、自噬内涵体，自噬溶酶体等，细胞质的降解区域被吞噬泡隔离开，吞噬泡进而转化成自噬体，自噬体是自噬的形态学特征，具有双层膜结构，包含着形态完整的细胞器。虽然电镜是检测自噬应用最广泛的方法，但同时也是最容易出问题的，主要是方法的问题：①选择被检测的标本是电镜检测自噬成功的关键。固定体外组织相对直接一些，但是要注意固定标本时去掉没有意义没有价值的部分；②双层膜并不是自噬体的超微结构标志，线粒体也是含双层界膜的细胞器，破坏的线粒体形态学与自噬体相似，但线粒体内膜有折瘠，而自噬体内膜不会折瘠；③有些情况下需要对电镜图像进行断层重建，进一步确定自噬结构是球形的，以免和其他在薄层外观上相类似的结构混淆，比如含有沉淀物的线粒体；④分析一个细胞单个层面的时候容易被误导或者难以分析自噬结构，如果有足够的结构分辨率便能够解决上述问题，而聚焦离子束/扫描双束电子显微镜能够更加简易的进行三维分析。另外被证明能够有效分析自噬中复杂膜结构的技术方法还包括三维电子断层扫描、冷冻电子显微镜、关联光电显微镜等（CLEM）对于确认自噬体很有帮助。 电镜虽然是检测自噬的金标准，但是应用电镜时必须非常严格操作避免偏倚，同时我们推荐静态的电镜图像配合串联mRFP-GFP-LC3有助于分析自噬流以及降解物的结构。采用动态观察的方法，多个时间点采集数据更能反映自噬流的真实情况。 2 荧光显微镜下采用融合蛋白示踪自噬 由于电镜耗时长，不利于监测自噬流，新近利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了GFP-LC3指示技术：无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数评价自噬活性的高低，但无法反映自噬体呈递至溶酶体的过程来从形态学上观察自噬流。而mRFP-GFP-LC3串联荧光蛋白腺病毒通过瞬时高效感染细胞，配合活细胞工作站能够做到实时监测自噬流，GFP和mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬体的融合形成自噬溶酶体。由于腺病毒载体感染效率高，很多细胞都能达到近99%，纯化后的腺病毒可以直接进行动物活体注射。另外LC3持续表达可能会影响细胞正常功能，因此腺病毒这种不整合基因组的载体更适合作为一种工具型病毒载体。这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流水平，是自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。 3 Western-blotting检测自噬底物的降解 通过标记细胞内部长寿蛋白的降解，或者通过Western-blotting确定降解底物含量的减少，均可用于佐证自噬的完成。起初自噬所降解的底物被认为是随机的，但是后来的研究表明有些蛋白是选择性降解的，在这些蛋白之中研究最为透彻的是蛋白P62，最近已经认为可以通过自噬特异性被降解，主要通过Western blotting方法检测P62蛋白水平的表达，一般情况下，P62蛋白水平的高低与自噬的活性成反比，P62的增加提示自噬/溶酶体降解途径被抑制，因此其表达量的变化也可用于监测自噬流。但是单纯依靠自噬底物蛋白的降解很难断定自噬的发生，因为自噬底物的蛋白往往参与细胞内部其他的信号通路的调节，此种蛋白可能通过其他的信号通路降解。更为准确的方法是，通过电镜或检测LC3-Ⅱ/Ⅰ，判断自噬的发生，并配合自噬调节剂如3-甲基腺嘌呤，如果能够抑制自噬底物降解，则说明整个自噬流的发生。 4 自噬流的人为干预 通过人为干预来促进或者抑制自噬功能后观察细胞行为或效应分子的变化能够使研究结论更具有说服力。目前认为促进或者抑制自噬的方法有药物处理、自噬基因敲除或过表达等。 在自噬过程中，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt/mTOR信号通路发挥主要作用，而PI3K是该通路的关键分子。根据底物特异性，PI3K又可以分为3类，Ⅰ类PI3K作为信号转导，在哺乳动物体内自噬发生的不同阶段起抑制自噬的作用，Ⅲ类PI3K在自噬发生过程中起主要作用，通过磷酸化磷脂酰肌醇形成3-磷酸磷脂酰肌醇，从而促进自噬的发生，而Ⅱ类PI3K与自噬的关系至今知之甚少。根据调控通路，可以将自噬调控剂分为：①PI3K抑制剂包括3-甲基腺嘌呤（3-MA）、渥曼青霉素和LY294002。其中应用最多的3-MA主要是通过抑制Ⅲ类PI3K活性，阻断3-磷酸磷脂酰肌醇的产生，影响自噬体的起始和成熟，从而抑制自噬的发生；②雷帕霉素靶蛋白抑制剂，mTOR作为自噬启动阶段的关键调节因子，活化后可抑制自噬的发生，其抑制剂包括雷帕霉素，雷帕霉素衍生物，AZD805，Torin1，PP242，WAY600等；③肌醇单磷酸酶抑制剂，包括氯化锂、卡马西平等；④氯喹与羟氯喹作为一类常用的自噬抑制剂，其抑制自噬的机制主要是通过改变溶酶体的pH值，影响溶酶体对底物的降解，同时阻断自噬体与溶酶体的融合从而影响自噬流。另外通过RNAi干扰自噬相关基因的表达后，细胞表现为自噬功能缺失。我们提倡人为干预自噬与多种自噬检测方法结合使用以获取可靠数据，将动态和静态检测方法结合，更能有效说明细胞自噬的发生以及自噬流的变化。 5 讨论 自20世纪50年代，细胞自噬研究的先行者ChristiandeDuve运用电子显微镜技术观察到自噬泡的存在，到Science认为细胞自噬为科技领域六大研究方向之一，自噬已经成为生物医学最热门的研究领域之一，特别是过去的10年见证了自噬研究的飞速发展。越来越多的研究表明自噬可能在多种疾病过程发挥重要作用，但既往的诸多研究却发现自噬在某些生物学过程中的利弊一直没有定论，我们分析其关键原因之一是自噬的评价方法不当。既往研究多以自噬体的多少评价自噬水平的强弱，然而Atg8/LC3水平的增加，或者甚至是自噬体的出现，这些并不能从本质上反映自噬的强弱，仅仅能够反映自噬的诱导，或者是自噬体、自噬内涵体清除的抑制。因为从自噬流的角度来看，自噬体的数量受形成和清除两方面影响。既往多认为自噬体增多是自噬过度导致生成过多所造成，而新近研究表明自噬体的蓄积多是自噬清除功能障碍所致，如何干预自噬体的清除及底物的降解可能成为今后的研究热点和新药开发方向。 转载注明来源:https://www./1/view-7467662.htm |
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