正所谓技多不压身,Western Blot(蛋白免疫印迹,简称 WB)作为生命科学研究领域最为平常的实验,它蕴含了很多知识,可谓是小实验里有大文章。WB 实验历时时间长,每一步都有可能出错,做实验的小伙伴们踩过的坑都可以说不胜枚举。今天我们就来探讨一下实验中可能会出现的问题,帮助大家避免踩坑。 01 蛋白提取 02 蛋白电泳
采用 SDS-PAGE 电泳,每孔上样等体积总蛋白,上样时,先加 marker,如有空置的加样孔,须加等体积的 1×loading buffer,以防相邻泳道样品的扩散。开始电压为 80 V,使样品跑得慢一些,充分浓缩,到达分离胶后调为 120 V,电泳至溴酚蓝要跑出即可终止电泳。关于电泳液,建议新鲜配制,也可先配 10x 的,然后现用现稀释。 Tips:蛋白电泳 1 2 3 4 5 03 蛋白转膜 膜的选择 1 现在用的最多的是 PVDF 膜,用之前需注意:①先在纯甲醇中浸湿膜 15 s,保证 PVDF 膜充分活化;②将膜放入转膜缓冲液中平衡至少 5 min。 2 NC 膜不需要甲醇活化。 膜的孔径 1 根据被转移的蛋白分子量大小,选择不同孔径的印迹膜。因为随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。 2 通常用 0.45 μm 和 0.2 μm 两种规格的印迹膜。大于 30 KD 的蛋白可用 0.45 μm 的膜,小于 30 KD 的蛋白就要用 0.2 μm 的膜。 小分子蛋白 1 小分子蛋白很容易转过,所以摸索适合自己蛋白的转膜条件很重要,这一步很难说一次就成功,所以刚开始的时候可以在接触胶面的 PVDF 膜上再放一张 PVDF 膜,转膜结束后,立春红染色,观察使用的条件是否会转过头。 2 小分子蛋白转膜液中一定不要加 SDS,因为 SDS 会影响转膜效果。 3 小分子蛋白湿转参考 100 V 恒压,或者 150~200 恒流,40~60 min,都可以跑出来结果,同时也可以保证内参的效果很好。 4 小分子蛋白转膜液甲醇浓度为 20%。 5 分子量小于 10 kDa 的多肽或蛋白,建议使用 Tricine-SDS-PAGE 电泳和转膜系统。 大分子蛋白 1 转膜时间要适当延长,220 V,300 mA,湿转,建议时间在 2.5 h~3 h,因为转膜时间很长,可以预冷转膜缓冲液,同时提前准备好足够的冰袋降温。 2 转膜液中可以加入适量 SDS(浓度 0.1%),对于大分子量蛋白加入 SDS 是为了增加了蛋白表面电荷,从而增加转膜效率。 3 大分子蛋白转膜液甲醇浓度为 5%。 04 印迹膜封闭 ➊ 脱脂奶是最常用的经济配方 ❷ 脱脂奶粉不能与生物素化的抗体一起使用,因为脱脂奶粉含有糖蛋白和生物素;建议使用 BSA。 ❸ 分析磷酸化蛋白须用 BSA。脱脂奶粉含磷酸酶,用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白受到影响,因为磷酸酶与膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化;也不适用于碱性磷酸酶(AP)检测系统。 ❹ 如果用辣根过氧化物酶(HRP)检测系统,封闭液不应加叠氮钠(NaN3),因为叠氮钠对辣根过氧化物酶(HRP)有灭活作用。 ❺ 如果用二抗抗体是碱性磷酸酶(AP)标记的检测系统,可使用酪蛋白封闭,同时须选择 TBS 缓冲溶液,不可使用 PBS 缓冲溶液,因为 PBS 缓冲溶液干扰碱性磷酸酶。 05 一抗二抗孵育 ➊ 建议孵育抗体之前一定要仔细看抗体说明书,了解抗体的种属来源和抗体的建议稀释比例。 ❷ 选择二抗抗体取决于一抗抗体的动物来源。例如,如果一抗抗体是小鼠来源单克隆抗体,二抗抗体必须是抗小鼠的抗体;如果一抗抗体是兔来源多克隆抗体,二抗抗体必须是抗兔的抗体。 ❸ 建议使用商品化的抗体稀释液稀释一抗二抗,不仅能有效减少一抗或二抗的非特异性结合,并有效提升稀释后抗体的稳定保存时间,可重复利用。 06 显影 ➊ 建议使用高信号强度、高灵敏度、高稳定性的 ECL 化学发光试剂。 ❷ 显影液务必覆盖整个印迹膜。 ❸ 显影液 A 液和 B 液吸取过程中必须更换移液器枪头,避免相互污染失效。 ❹ ECL 工作液需避免强氧化剂如次氯酸钠等对工作液的影响。 ❺ 须确保试剂瓶干净,无微生物或其它试剂污染。为了小伙伴们的安全,请穿实验服并佩戴一次性手套。 Western Blot 检测试剂盒 货号:AR0040 | 规格:5T/50 样品 ¥860 看不清具体包含哪些东西,别担心,详见表格—— 怀疑他的质量如何,没事,实力说话—— 如上图,使用抗Bax兔多克隆抗体(A00183)进行的蛋白质印迹分析。在 12% SDS-PAGE 凝胶上,以 80 V(浓缩胶)/120 V(分离胶)进行电泳 2~3 h。在变性条件下,每个泳道的样品孔中装有 50 μg 样品。 泳道1:大鼠胸腺组织裂解液, 泳道2:小鼠胸腺组织裂解液, 泳道3:HEPA1-6 全细胞裂解液, 泳道4:Hela 全细胞裂解液, 泳道5:MCF-7 全细胞裂解液。 电泳后蛋白转移至 PVDF 膜上。在室温下,用 5% 脱脂牛奶/ TBS 封闭膜 1.5 h。将该膜与抗 Bax 抗体在 4 ℃ 孵育(0.5 μg/mL)过夜,然后用TBS-T 洗涤 3 次,每次 5 min,并用羊抗-兔 IgG-HRP 二抗(1:10000 稀释)在室温下孵育 1.5 h,然后用 TBS-T 洗涤 3 次,每次 5min,使用 ECL 发光检测液,Tanon 5200 成像仪显影,在大约 21 KD 处检测到目的条带。 还不够?OK,再来一张单抗实验结果—— 如上图,使用抗 Desmin(BM0036)(MW:54KD)鼠单克隆抗体进行的蛋白质印迹分析。在 10% SDS-PAG E 凝胶上,以 80 V(浓缩胶)/120 V(分离胶)进行电泳 2~3 h。在变性条件下,每个泳道的样品孔中装有 50 μg 样品。 泳道 1:大鼠骨骼肌组织裂解液, 泳道 2:大鼠心肌组织裂解液, 泳道 3:小鼠骨骼肌组织裂解液, 泳道 4:小鼠心肌组织裂解液。 电泳后蛋白转移至 PVDF 膜上。在室温下,用 5% 脱脂牛奶/ TBS 封闭膜 1.5 h。将该膜与抗 Desmin 抗体在 4 ℃ 孵育(0.5 μg/mL)过夜,然后用 TBS-T 洗涤 3 次,每次 5min,并用羊抗小鼠 IgG-HRP 二抗(1:10000 稀释)在室温下孵育 1.5 h,然后用 TBS-T 洗涤 3 次,每次 5min,使用 ECL 发光检测液,Tanon 5200 成像仪显影,在大约 53 KD 处检测到目的条带。 |
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