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摘 要：目的 运用网络药理学方法预测柴胡加芒硝汤治疗功能性便秘的功效作用网络和潜在机制。方法 通过TCMSP、TCMID及Swiss Target Prediction在线预测数据库，以口服利用度（OB）和类药性（DL）作为限定条件对柴胡加芒硝汤的成分及其靶点进行收集和筛选；从PubMed、CTD、TTD、DrugBank等数据库对功能性便秘相关的靶点进行检索；利用STRING和Cytoscape分析软件对所得靶点进行网络可视化处理，并筛选节点度较高的关键成分和核心靶点；借助Cytoscape及其插件对其核心靶点进行富集分析，预测作用机制。结果 筛选出柴胡加芒硝汤总成分共206个，其对应靶标有998个；功能性便秘的疾病靶点有295个；经分析获知涉及柴胡加芒硝汤治疗功能性便秘作用的有64个关键成分和30个核心靶点，对核心靶点进行GO富集分析及KEGG途径分析，SCN9A、CFTR、HTR2A、OPRD1、PTGS1、FGFR1等30个核心靶标主要通过阿片受体活性、机体的水平衡、萜类物质的代谢和生物胺配基结合受体的活性等多个生物过程和分子功能，以调节5-羟色胺受体、花生四烯酸代谢、MECP2的转录调控、细胞色素P450、生物胺配基结合受体、PI3K的异常表达、络氨酸蛋白激酶信号通路、外源性异物刺激等作用通路发挥对便秘的治疗作用。结论 柴胡加芒硝汤治疗功能性便秘的作用机制呈现多靶点、多通路的特点，其皂苷类、黄酮类、甾醇类物质可能是其发挥核心功效的物质基础，5-羟色胺类受体、阿片类受体、氯离子通道调控受体可能是其关键作用靶点。 功能性便秘（functional constipation，FC）是功能性肠病的一种，是指由非器质性原因引起的便秘，又称特发性便秘，可分为排空迟缓型、功能性出口梗阻型和合并或混合型。其典型临床表现为长时间持续性排便困难、排便不尽感或无便意感[1]。FC属中医“便秘”范畴，基本病机为大肠传导中的“魄门亦为五脏使”说明便秘的形成与脾、胃、肝、肾、肺等脏腑功能失调有关。据其病机将便秘分为实证和虚证，实证为肺热下移大肠或胃肠积热，致大肠津液干枯，传导失职；虚证为素体虚弱或久病之后，气虚大肠传导无力。现代医学对FC发病机制研究等多种因素有关。 柴胡加芒硝汤出自《伤寒论》，由柴胡二两十铢（8 g）、黄芩一两（3 g）、人参一两（3 g）、炙甘草一两（3 g）、生姜一两（切）（3 g）、半夏二十铢（洗）（2.1 g）、大枣四枚、芒硝二两（6 g）共8味药组成，从方剂组成和用量来说，柴胡加芒硝汤是由小柴胡汤三分之一的剂量加入芒硝而成，方中主要化学成分有柴胡皂苷类、黄芩苷类、人参皂苷类等多种活性物质以及矿物含水硫酸钠，具有和解少阳、泻热去实的功效。根据《伤寒论》第104条的描述“伤寒十三日，不解，胸胁满而呕，日晡所发潮热，已而微利。此本柴胡证，下之以不得利，今反利者，知医以丸药下之，此非其治也。潮热者，实也。先宜服小柴胡汤以解外，后以柴胡加芒硝汤主之。”与伤寒病结合六经证治的认识[7]，此方与小柴胡汤先后使用，用于治疗太阳十三日不解旁涉阳明，波及肠腑引起的里热实证便秘，同时还可用于调畅三焦气机治疗因选择“丸药”下法误治太阳旁涉阳明实热便秘引起的正气受损[8]。现代临床也发现柴胡加芒硝汤治疗FC有一定疗效，但相关作用靶点和药效物质基础均尚不明确。网络药理学是系统生物学的重要组成部分，其注重药物间相互作用的特点与中医药学多采用复方配伍治疗相吻合，通过“成分-靶点”和“疾病-靶点”2大系统网络的预测，为传统方剂现代药理学研究与机制探讨提高了准确度，也搭建了“桥梁”。因此，本研究采用网络药理学方法，通过构建方剂化合物靶标和疾病靶标的互作网络，从分子功能和通路机制上预测柴胡加芒硝汤治疗FC的关键成分与潜在机制。 1 方法 1.1 柴胡加芒硝汤所含成分及其对应靶点的收集和筛选 本研究采用中药系统药理学分析平台TCMSP（http://lsp./tcmsp.php），以柴胡、黄芩、人参、甘草、生姜、半夏、大枣为关键词，检索这7味药的化学成分。借助TCMID（http://www.ehbio. com/TCMIP/index.php/Home/Index/index.html）平台查找TCMSP未收录的芒硝的化学成分。本研究结合口服生物利用度（OB≥30%）和类药性（DL≥0.18），对所收集到的化学成分进行筛选，并结合《中国药典》2015年版中药物的含量测定项对已筛选的化合物进行补充，最终建立柴胡加芒硝汤的成分数据库。从TCMSP中查询柴胡加芒硝汤化合物对应的靶标蛋白，并在Unitprot数据库（http://www. Unitprot.org/）查询靶标蛋白的基因名称。对于尚未在TCMSP中收录靶点的化合物，在PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm./）查询化合物的Canonical SMILES序列，并利用此序列在Swiss Target Prediction在线数据库（http://www. swisstargetprediction.ch/）中对该化合物的靶点进行预测，收集预测结果中的靶标蛋白基因名称。 1.2 FC疾病靶点的预测 在TCMID数据库、TTD数据库（http://s. edu.sg/）、CTD数据库（http:///）、PubMed数据库（https://www.ncbi.nlm./pubmed）中以关键词“functional constipation”或“constipation”进行检索，对FC相关的靶点进行收集。通过阅读FC临床诊疗指南总结出治疗FC的上市药物，在DrugBank数据库中进行检索（https://www. drugbank.ca/），收集相关药物的作用靶点。将以上检索结果合并，去除重复值，作为FC的预测靶点库。 1.3 成分-靶点网络、蛋白互作（PPI）网络的构建 利用Cytoscape 3.6.0软件建立柴胡加芒硝汤筛选后成分与成分预测靶点的“柴胡加芒硝汤-活性成分-预测靶点”网络。将柴胡加芒硝汤化合物的作用靶点进行合并，删除重复值，利用String在线数据库（https:///）对FC疾病的预测靶点和柴胡加芒硝汤成分的作用靶点分别构建蛋白互作网络，并以TSV格式导出2个PPI网络的分析结果。利用Cytoscape软件对2个网络进行交集分析，得到化合物-疾病的共有靶点，利用交集出的共有靶点结合化合物成分建立柴胡加芒硝汤化合物-FC靶点的PPI网络。利用Cytoscape软件对化合物-FC靶点蛋白互作网络进行节点度（dregree）值筛选，得到关键成分和核心靶点，并构建核心成分-关键靶点互作网络。 1.4 GO生物学功能分析及KEGG通路富集分析 利用Cytoscape 3.6.0软件中的ClueGO插件针对核心成分-靶点互作网络进行GO分析和通路富集分析，通过通路富集结果对柴胡加芒硝汤治疗FC的机制进行预测。 1.5 FC机制的文献挖掘 2 结果与分析 2 从TCMSP、TCMID数据库中搜索柴胡加芒硝汤各味药的化合物成分，并依据OB≥30%及DL≥0.18要求，得到最终选定的结果为206个化合物，其中柴胡18个、黄芩34个、人参24个、甘草94个、生姜8个、半夏12个、大枣26个、芒硝2个。从TCMSP数据库获取所选化合物的靶标蛋白，在TCMSP信息不足时，用化合物的CanonicalSMILES序列在SwissTarget Prediction在线数据库进行预测，将预测靶点作为补充录入成分-靶点库。利用Cytoscape软件进行“柴胡加芒硝汤-成分-预测靶点”网络的构建，见图1。 2.2 成分靶点-疾病靶点的互作网络构建与分析 在TTD、CTD、PubMed、TCMID数据库中以关键词“functional constipation”或“constipation”进行检索，收集与FC相关的靶点，在DrugBank数据库检索上市药物的作用靶点。将以上检索结果合并，并去除重复值，得到326个疾病靶点。 采用STRING在线数据库（http:///）构建蛋白相互作用网络。利用Multiple proteins工具，限定物种为人（Homo sapiens），获取PPI网络，并保存其TSV格式文件，得到图2-A，共涉及282个节点，1 524条边。采用相同方法对柴胡加芒硝汤成分的靶点进行PPI网络的构建，得到图2-B，共涉及939个节点，25 285条边，并保存其TSV格式文件。 利用TSV文件在Cytoscape中编辑PPI网络，使用Merge功能整合化合物-疾病的交集靶点，并构建化合物-疾病交集靶点与柴胡加芒硝汤成分的互作网络，采用节点degree值筛选的方法对互作网络进行分析，见图3，其中左侧中心表示皂苷类、黄酮类、甾醇类等关键成分64个。右侧中间红色是靶点的筛选结果，共得OPRD1、CFTR、HTR2A等30个核心靶点。对柴胡芒硝汤治疗FC的30个核心靶点进行可视化处理，结果共涉及30个节点，65条边，见图4-A。图中的节点表示蛋白，边表示蛋白间的相互关联，互作网络中图节点的大小与此节点的degree值呈正比。查阅关键靶点蛋白的生物学活性，按生物学活性分类，见图4-B。从分类结果可知，核心靶点生物学活性主要分布于5-羟色胺受体、腺苷酸环化酶相关受体、络氨酸蛋白激酶受体、对外源性异物刺激的反应等几个相关通路中。 2.3 成分-疾病交集靶点GO生物学功能分析及KEGG通路富集分析 将总结的柴胡加芒硝汤治疗FC的30个核心靶点通过Cytoscape中的插件ClueGO进行通路富集分析和生物学功能分析。结果见图5、6。 阿片受体活性（opioid receptor）、机体的水平衡、胺配基结合受体的活性（response to ammoniumion）等多个生物过程及分子功能相关。 从图6可知，对30个核心靶标所参与的主要KEGG通路富集信息进行分析，得柴胡加芒硝汤主要通过调节花生四烯酸代谢（arachidonicacid metbolism）、MECP2的转录调控（transcriptional regulation byMECP2）、细胞色素P450（cytochrome P450-arranged bysubstrate type）、生物胺配基结合受体（amineligand-binding receptors）、5-羟色胺受体（serotoninreceptors）、PI3K的异常表达（constitutive signaling by aberrantPI3K in cancer）、受体型蛋白酪氨酸激酶（signalingby FGFR1）、外源性异物刺激（xenobiotics）等作用通路发挥对FC的治疗作用。 2.4 结合文献挖掘的结果对柴胡加芒硝汤治疗FC的机制进行确认 通过文献挖掘[9-21]，对FC的发病机制、一线治疗药物的药效机制和以FC为副作用的部分药物作用机制等进行总结，见图7。总结对应的机制发现柴胡加芒硝汤主要通过调节钙离子受体、调节阿片类受体、激动5-HT受体、调节氯离子膜上转运受体、影响G蛋白偶连受体等通路发挥对FC的治疗作用，预测相关靶点分别为OPRD1、OPRK1、OPRM1、CFTR、CAMK2B、HTR2A、HTR2B、HTR2C、HTR3A。 3 讨论 柴胡加芒硝汤载于《伤寒论》，属“胆与胃肠兼证用方”为和解少阳，泻热去实之剂[1]。目前尚未发现柴胡加芒硝汤治疗FC的药理学研究和临床应用的报道。但有小柴胡汤及其加减方治疗肠道气滞型FC临床报道与研究[22]，可有效缓解心情焦虑引起肝失疏泄，肠气不通、糟粕内停，大肠传导失司，即肠道气滞型FC。《神农本草经》言柴胡主“肠胃中结气，饮食积聚，寒热邪气，推陈致新”，说明柴胡可促进脏腑的新陈代谢，能推动少阳枢机，并由此起到调和表里作用[23]。半夏、生姜能疏通郁滞，调理脾胃升降。胃气以降为顺，胃气不降多由火旺气实所致，故予黄芩清火即是降胃气；脾气以升为常，故用人参、甘草、大枣益气，又能推动大肠传导之力[24]。方中芒硝功效为“泻下通便、润燥软坚”，服用后在肠道内形成高渗盐溶液，吸附大量水分，扩张肠道引起机械刺激，从而促进排便，其导泻机制与容积性泻药接近[10]。参考《伤寒论》用法，先服用小柴胡汤去外邪，通畅三焦之郁证，后用柴胡加芒硝汤泻热去实，兼轻通三焦，适用于少阳病兼有里实证或大便不通，苦满难解之里实证，或热入血室如疟状，胸腹胀满，大便不通或坚硬者。以疏泄肝气、通利三焦、顺气通便以达到清气上升、浊气下降、腑气得通的目的，且攻补兼施，在临床上应用于实秘或者虚秘均能取得较好的效果。因此由小柴胡汤和柴胡加芒硝汤的先后使用可推测，柴胡加芒硝汤以调畅气机和泻里实热的治法对FC进行了治疗。 本研究利用网络药理学的方法探讨了柴胡加芒硝汤治疗FC的成分与作用机制，预测治疗相关成分为柴胡皂苷、黄芩素、人参皂苷、汉黄芩素、槲皮素、β-谷甾醇、α菠菜甾醇等64个关键成分。预测此方对FC的治疗机制可能是以调节氯离子通路、钙离子通路、兴奋性和抑制性的神经递质和和G-蛋白偶连受体等几个关键的通路，均为临床FC治疗药物的明确机制[10]。其中5-HT是重要的胃肠神经递质[25]，几个离子通道和5-HT受体均可通过调节神经传导改善胃肠动力[26]，文献研究证实，预测的柴胡加芒硝汤对FC的治疗机制与部分目前上市产品如鲁比前列酮[27-28]、普芦卡必利[29]等药物作用机制接近，借此，可确认柴胡加芒硝汤对FC治疗的网络药理学分析结果有一定的准确性。另外，此方还可影响花生四烯酸代谢通路和肝脏的细胞色素P450酶、络氨酸蛋白激酶等信号通路，调节机体消化、循环等多个系统和机体对药物的代谢。说明柴胡加芒硝汤对FC的治疗机制不仅在于调节神经传导，还影响了体内多种代谢途径。 传统方剂对疾病的辨证论治，是多成分、多靶点，通过多味中药的协调配合共同实现对机体功能的调节，本研究中筛选得到的柴胡加芒硝汤治疗FC的64个关键化合物，但芒硝作为以泻热通便为功效的成分却不在其中，推测原因可能是芒硝作为结晶水矿物通过吸水增大肠道容积促进排便，而不是化合物与靶点的直接作用。另外，也可能因为数据库信息尚不全面，没有在PPI网络中发现柴胡芒硝汤成分对肠道结肠肌神经丛的P物质[30]、抑制神经递质的血管活性肽VIP[16]及调节肠道水液靶点- AQP3[22]等便秘病因机制的作用，因此，对所预测的关键成分、调控机制仍需做进一步的实验验证。其调控机制与中医的“和”法治疗中调畅气机、解三焦之郁是否有某种形式的联系，也有待进一步的验证和研究。 来 源：吴恺怿，郭 欣，黄娜娜，刘 静，孙 蓉. 基于网络药理学模式的柴胡加芒硝汤治疗便秘的系统功效研究与机制预测 [J]. 中草药, 2019, 50(21): 5170-5177. |
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