引物上新｜三大数据库基因全覆盖1、NCBIRefseq（NCBIReferenceSequence）数据库中基因类型为lncRNA，p
rotein-coding，pseudo的全部基因；2、mirbase数据库中human，mouse，rat全部成熟体序列micr
oRNA；3、circbase数据库中human，mouse全部circRNA；其次，也是最重要的，就是基因坚持的三个最重要的设计
原则：1、引物跨内含子设计，避免基因组污染带来的影响；2、引物在基因（NCBIRefseq）对应的所有转录本同源区设计；3、引物
特异性，设计引物全部使用NCBIprimer-blast比对工具进行引物特异性比对；最后，就是设计方法。qPCR使用的方法都是是
染料法，使用的荧光染料就是常用的SYBRGreenI。该方法利用了SYBRGreen荧光染料非特异性与双链DNA结合并发光的特性
，检测PCR的全部进程，从而判定初始RNA的量。染料法的优势是使用简单，成本也相对较低。下面简单介绍下mirbase数据库和cir
cbase数据库中两类基因的qPCR引物设计方法。1、circbase数据库中circRNA引物设计方法-常规qPCR设计方法Ci
rcRNA成环方式有很多种，简单说明下外显子环化的circRNA和内含子环化的circRNA两类设计方法。对于外显子环化的circ
RNA，引物需要跨剪切位点（backsplice）设计；对于内含子环化circRNA，可跨剪切位点设计，也可围绕内含子区域设计引物
。circRNA的正向引物和反向引物（DivergentPCR）与线性mRNA的正向引物和反向引物（convergentPC
R）设计方向刚好是相反的。circRNA跨剪切位点（backsplice）设计示意图如下：2、mirbase数据库中成熟体micr
oRNA引物设计方法-茎环法由于成熟体miRNA较小，无法用常规的方法直接进行反转录、PCR。所以对于mirbase数据库中的成
熟体microRNA使用的是茎环法，也就是将miRNA配对的序列延长，然后进行正常的反转录及后续的PCR检测。茎环法原理图如下：引
物产品具有高扩增效率和高灵敏度的特点，保证每次实验的可靠定量，无非特异性扩增和引物二聚体，确保实验的可重复性和实验数据的可靠性。 |
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