【原】GATK4 最佳实践-生殖细胞突变的检测与识别

GATK4 对于体细胞突变和生殖细胞突变的检测分别给出了对应的pipeline:

1. Germline SNPs+Indels

2. Somatic SNVs + Indels

本篇主要关注生殖细胞突变的分析流程Germline SNPs+Indels。示意图如下：

图中红色方框部分的从Analysis-Ready Bam 到，主要包括以下4步

1. HaplotyperCaller in GVCF mode

2. ImportGenomicsDB Consolidate GVCFs

3. GenotypeGVCFs

4. Filter Variants by Variabt Recalibration

官网给出了6套用于参考的pipeline

主要分析步骤都差不多，这里我选择第4个通用的流程 ，网址如下

https://github.com/gatk-workflows/gatk4-germline-snps-indels

1.  HaplotyperCaller in GVCF mode

对于每个样本，采用HaplotyperCaller计算突变位点，命令如下

gatk --java-options "-Xmx6G -XX:GCTimeLimit=50 -XX:GCHeapFreeLimit=10"    HaplotypeCaller    -R ${ref_fasta}    -I ${input_bam}    -L ${interval_list}    -O ${output_filename}    -contamination 0 -ERC GVCF

ref_fasta代表参考基因组的fasta文件;input_bam代表预处理阶段产生的 bam文件；interval代表interval list文件，如果指定这个参数，只会输出指定区域的突变信息。对于全基因组测序，不需要这个参数，对于外显子和目的区域捕获测序, 则需要这个参数；output_filename代表每个样本输出的gvcf文件的名字。

2. ImportGenomicsDB Consolidate GVCFs

将所有样本的gvcf文件合并，产生一个总的gvcf文件，命令如下：

gatk --java-options -Xmx2G      MergeVcfs    --INPUT ${sep=' --INPUT ' input_vcfs}    --OUTPUT ${output_filename}

3. GenotypeGVCFs

包括两个步骤，第一步，导入MergeVcfs合并好的gvcf文件， 命令如下

gatk --java-options "-Xmx4g -Xms4g"    GenomicsDBImport    --genomicsdb-workspace-path ${workspace_dir_name}    --batch-size ${batch_size}    -L ${interval}    --sample-name-map ${sample_name_map}    --reader-threads 5    -ip 500

workspace_dir_name代表输出目录;batch_size指定同时访问的最大文件数，默认值为0，表示同时访问所有样本的文件；interval代表interval list文件，如果指定这个参数，只会输出指定区域的突变信息。对于全基因组测序，不需要这个参数，对于外显子和目的区域捕获测序, 则需要这个参数；sampple_name_map是一个文件，记录了样本名称和每个样本对应的gvcf文件的路径。格式如下

sample1      sample1.vcf.gz
sample2      sample2.vcf.gz
sample3      sample3.vcf.gz

第二步， 运行GenotypeGVCFs，命令如下

gatk --java-options "-Xmx5g -Xms5g"    GenotypeGVCFs    -R ${ref_fasta}    -O ${output_vcf_filename}    -D ${dbsnp_vcf}    -G StandardAnnotation    --only-output-calls-starting-in-intervals    --use-new-qual-calculator    -V gendb://$WORKSPACE    -L ${interval}

需要注意-V 参数，指定的是GenomicsDBImport输出目录的路径。

4. Filter Variants by Variabt Recalibration

第一步，过滤vcf文件，条件为ExcessHet大于给定的阈值，命令如下：

gatk --java-options "-Xmx3g -Xms3g"    VariantFiltration    --filter-expression "ExcessHet > ${excess_het_threshold}"    --filter-name ExcessHet    -O ${variant_filtered_vcf_filename}    -V ${vcf}

excess_het_threshold指定ExcessHet的阈值；variant_filtered_vcf_filename代表输出的vcf文件的名字；vcf代表GenotypeGVCFs 生成的vcf文件的名字。注意，不满足条件的记录也会出现在最终生成的vcf文件中, 只不过对应的Filter字段的信息不是PASS。

第二步，删除vcf文件中的基因型信息，命令如下

gatk --java-options "-Xmx3g -Xms3g"    MakeSitesOnlyVcf    --INPUT ${variant_filtered_vcf_filename}    --OUTPUT ${sites_only_vcf_filename}

第三步，合并不同区间的vcf文件，并建立索引

gatk --java-options "-Xmx6g -Xms6g"  GatherVcfsCloud  --ignore-safety-checks  --gather-type BLOCK  --input ${inputs.list}  --output ${output_vcf_name} gatk --java-options "-Xmx6g -Xms6g"   IndexFeatureFile   --feature-file ${output_vcf_name}

output_vcf_name代表输出的vcf文件；inputs.list指定不同区间的vcf文件的路径，格式如下

cohortA_chr1.vcf.gz
cohortA_chr2.vcf.gz

第四步，分别评估SNP和INDEL突变位点的质量, 命令如下

gatk --java-options "-Xmx24g -Xms24g"    VariantRecalibrator    -V ${sites_only_variant_filtered_vcf}    -O ${recalibration_filename}    --tranches-file ${tranches_filename}    --trust-all-polymorphic    -tranche ${sep=' -tranche ' recalibration_tranche_values}    -an ${sep=' -an ' recalibration_annotation_values}    -mode INDEL    --max-gaussians 4    -resource mills,known=false,training=true,truth=true,prior=12:${mills_resource_vcf}    -resource axiomPoly,known=false,training=true,truth=false,prior=10:${axiomPoly_resource_vcf}    -resource dbsnp,known=true,training=false,truth=false,prior=2:${dbsnp_resource_vcf} gatk --java-options "-Xmx100g -Xms100g"      VariantRecalibrator      -V ${sites_only_variant_filtered_vcf}      -O ${recalibration_filename}      --tranches-file ${tranches_filename}      --trust-all-polymorphic      -tranche ${sep=' -tranche ' recalibration_tranche_values}      -an ${sep=' -an ' recalibration_annotation_values}      -mode SNP      --sample-every-Nth-variant ${downsampleFactor}      --output-model ${model_report_filename}      --max-gaussians 6      -resource hapmap,known=false,training=true,truth=true,prior=15:${hapmap_resource_vcf}      -resource omni,known=false,training=true,truth=true,prior=12:${omni_resource_vcf}      -resource 1000G,known=false,training=true,truth=false,prior=10:${one_thousand_genomes_resource_vcf}      -resource dbsnp,known=true,training=false,truth=false,prior=7:${dbsnp_resource_vcf}

resource指定建模时参考的vcf文件，可以看到对于indel和snp, 参考的数据库不一样。这一步只是建模，会输出一个recalibration table文件，用于ApplyVQSR命令。

第五步，运行VQSR, 命令如下

gatk --java-options "-Xmx5g -Xms5g"    ApplyVQSR    -O tmp.indel.recalibrated.vcf    -V ${input_vcf}    --recal-file ${indels_recalibration}    --tranches-file ${indels_tranches}    --truth-sensitivity-filter-level ${indel_filter_level}    --create-output-variant-index true    -mode INDEL gatk_path --java-options "-Xmx5g -Xms5g"    ApplyVQSR    -O ${recalibrated_vcf_filename}    -V tmp.indel.recalibrated.vcf    --recal-file ${snps_recalibration}    --tranches-file ${snps_tranches}    --truth-sensitivity-filter-level ${snp_filter_level}    --create-output-variant-index true    -mode SNP

input_vcf文件为GatherVcfsCloud生成的vcf文件，先校正INDEL位点，后校正SNP位点。