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高级遗传学:药物基因组学及其原理

2019-12-26  maidouexo

简述FISH技术的基本原理及其在医学生物学研究中的应用。

FISH技术的基本原理:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的,二者经变性-退火-复性,即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素,可利用该报告分子与荧光素标记的特异性亲和素之间的免疫化学反应经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。

应用:该技术不但可用于抑制基因或序列的染色体定位而且也可以用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究在基因定性、定量、整合/表达等方面的研究中颇具优势。

简述RNA SEQUENCING在单基因病研究和诊断中的意义和应用。

使用RNA-seq可以通过直接探测RNA丰度和RNA序列的变异来补充全外显子测序获得的遗传信息的局限性。RNA-seq在以下三种情况中尤为适用:首先是启动子和增强子的罕见变异,或者内含子区域的罕见变异所引起的基因异常表达。其次是等位基因特异性表达的极端情况,其中一个等位基因被沉默,仅剩下另一个等位基因表达。第三是基因的异常剪接,由于遗传剪接涉及复杂的顺势调控元件,很难仅根据遗传序列预测剪接缺陷,而RNA-seq直接探测剪接同工型,并导致了基于单基因研究的多个剪接缺陷的发现。总之,RNA-seq有望成为促进罕见单基因病分子诊断的重要补充工具。

简述药物基因组学及其原理,举例说明其临床应用和进展。

药物基因组学:是研究基因序列的多态性与药物效应多样性之间的关系,即基因本身及其突变体与药物效应相互关系的一门科学。其原理是基于功能基因组学与分子药理学的结合;不是以发现人体基因组基因为主要目的,而是在整个基因组水平上研究遗传因素对药物治疗效果的影响,相对简单地运用已知的基因理论改善病人的治疗。

目前,药物基因组学广泛应用于高血压、哮喘、高血脂、内分泌、肿瘤等的药物治疗中。如原发性高血压是多因素诱发的疾病,对于许多患者,高血压药物的不同药效和耐受性与遗传变异有关。Ferrari发现,内收蛋白(一种细胞骨骼蛋白)的基因多态性与高血压的发病、对钠敏感性以及对利尿剂的效果相关。因此在抗高血压治疗需要用利尿剂时,可以对患者预先进行基因检测,以确定是否选择使用此药。

简述DNA多态性的种类及其在医学遗传学中的应用。

DNA多态(分子水平的遗传多态):

1.   限制性片段片段长度多态性(RFLP):DNA序列的变化,甚至于一个核苷酸的变化,就可能引起某个限制性内切酶切点的丢失或产生,导致酶切片段长度的变化。

2.   VNTR:基因组中存在的小卫星DNA是由短的DNA序列串联重复组成,重复次数在人群中高度变异,当用限制酶切割VNTR区域时,只要酶切位点不在重复区,就可以得到各种长度不同的片段。

3.   单核苷酸多态(SNP):基因组内特定核苷酸位置上存在两种不同的碱基,其中最少的一种在群体中的频率不少于1%,平均每隔100—300bp有一多态位点。

遗传多态的医学意义及应用:

1.   连锁分析与基因定位

2.   疾病的关联分析

3.   复杂疾病或过程的基因定位

4.   法医学应用:个人识别,亲权鉴定等

5.   疾病发病的分子遗传机理的阐明:镰刀血红蛋白贫血

6.   环境因子易感基因的检出

7.   指导用药和药物设计(肝酯酶基因启动子区的一个多态与他汀类降血脂的效果有高度的相关性)

列举基因治疗的几类载体及其特点。

基因治疗的载体主要分为两大类:病毒载体和非病毒载体。病毒载体包括反转录病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体和慢病毒载体等。非病毒载体包括脂质体、直接注射或微粒轰击、受体介导内吞等。

反转录病毒载体的优点是能高效感染宿主细胞,整合如染色体随细胞分裂传代,最大克隆的容量是8kb;缺点是随机整合导致成瘤风险,转染分裂期细胞。

腺病毒载体的优点是能高效感染分裂期和非分裂期细胞;最大克隆的容量是35kb;非整合减少插入突变;缺点是表达时间短(2-4w),用于基因高水平的瞬时表达;有免疫原性。

腺病毒相关病毒载体的优点是感染分裂期和非分裂期细胞,免疫反应小,在单基因遗传病基因治疗领域广泛应用;缺点是最大克隆量只有4.5kb。

慢病毒载体优点是多种非分裂细胞进行高效的转染和长期稳定表达,逐渐成为基因治疗领域的新生力量;缺点是随机整合成瘤风险。

脂质体优点是容易制备,对转移DNA大小无限制;缺点是转移效率低;导入DNA不整合入染色体,瞬时转染。

直接注射的优点是简单且安全,但是转染效率低。

简述致癌基因,抑癌基因及其突变方式,举例说明抑癌基因。

原癌基因是细胞的正常基因,其表达产物对细胞的生理功能极其重要,只有当原癌基因发生结构改变或过度表达时,才有可能导致细胞癌变。

(一)点突变:C--ras:12、13、61位密码子点突变,存在于多种肿瘤。

(二)染色体易位:1、因易位使原癌基因与另一基因形成融合基因,产生一个具有致癌活性的融合蛋白,如t(9:22)使c-abl与bcr融合,产生一个致癌的P210蛋白。2、因易位面使原癌基因表达失控,如t(8:14)易位使c-myc表达失控。

(三)基因扩增:即基因拷贝数增加,如HL-60和其它白血病细胞,C-myc扩增8-22倍.其它:c-erb B,c-net。

(四)LTR插入,LTR是逆转录病毒基因组两端的长末端重复,其中含有强启动子序列。

(五)致癌基因低甲基化改变。

抑癌基因是延缓细胞分裂、修复DNA错误或告诉细胞何时死亡(即细胞凋亡或程序性死亡)的正常基因。当抑癌基因不能正常工作时,细胞就会失去控制,从而导致癌症。

(一) 杂合性等位基因的缺失。

(二) 等位基因的突变。

(三) 基因5’端CpG岛胞嘧啶高度甲基化,抑制抑癌基因的转录。

Rb基因是第一个被克隆的抑癌基因,Rb在非磷酸化状态下可以与转录因子E2F结合,并抑制其活化基因表达的功能。磷酸化的Rb不能与E2F结合。此外,Rb基因抑制c-myc、c-fos等基因的转录,负调控细胞增殖;还结合存在与细胞中的异常蛋白、病毒蛋白防止其使细胞转化。Rb基因异常(等位基因缺失和基因突变),与视网膜母细胞瘤的发生高度相关,后来在多种肿瘤中都发现了该基因的异常,如小细胞肺癌50%,骨肉瘤47%,乳腺癌32%。

组学是什么,它与暴露组学和表型组学有什么关系。

组学通常是指生物学中对各类研究对象的集合所进行的系统性研究,例如,基因组学、蛋白质组学和代谢物组学等,而这些研究对象的集合被称为“组”。暴露组包括个体一生所经历的每一次暴露。暴露来源于两大类:内源性和外源性。其中,内源性暴露包括体内环境核内原想过程中产生的生物标志物,内暴露的评估以来组学技术。表型组包括某一生物的全部性状特征,表型组学是在多组学水平上系统研究某一生物或细胞在各种不同环境条件下所有表型的学科,而表型组中的内表型(包括基因表型等)的评估也是依赖组学技术。三大组学的关系是:基因优先与表型优先。

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