值得关注的单细胞代谢组学

高精度质谱法和先进的细胞采样技术使研究人员得以分析单细胞中的代谢物。但这一领域仍处于起步阶段。

分析化学家Renato Zenobi介绍了当今细胞生物学家面临的根本问题之一——细胞异质性。他分析了一个分子在细胞群体中浓度分布的理论曲线——一个简单的钟形分布。据他解释，这种分布可能会掩盖分子分布的复杂性。为了证明这一点，他以分布在最高点两侧的两条曲线为例——这两条曲线都符合钟形分布，但代表的是截然不同的两种细胞亚型。苏黎世瑞士联邦理工学院（Swiss Federal Institute of Technology, ETH）的Zenobi指出，要真正了解分布是多模式还是双模式，您需要从单细胞水平上去研究分子分布。

为什么一个菌落中的部分细菌可以产生抗细菌抗性，而其它细菌不能？答案就是细胞异质性。大脑中为什么有不同类型的细胞亚型？为什么部分肿瘤会复发？诸如此类的问题，答案都在于细胞异质性。现在，我们终于有了可以研究这种差异的工具。

美国国立卫生研究院（NIH）共同基金（Common Fund）单细胞研究工作组的项目负责人Ananda Roy表示，最近的技术进步，特别是过去两年里运用的新技术进展都表明，即便是同一细胞亚群中的个体细胞，它们之间都存在巨大差异。这些差异可能会对健康和疾病产生重要影响。全球基金提供者都大力支持单细胞研究。NIH已启动单细胞研究资助计划，2014年资助额度为200万美元，目前已有近60个团体获得了该计划的奖励。在日本，大学和企业合作成立了单细胞测量师协会（Society for Single-Cell Surveyor）。该协会资助和举办了关于单细胞分析和技术的研讨会。今年10月，专家们讨论了启动人类细胞图谱项目（International Human Cell Atlas Initiative），该计划旨在分析每种类型的人类细胞及其性质。不得不说，这是一项主要依靠单细胞分析的，非常雄心勃勃的任务。

这项工作的大部分重点是从DNA水平揭示细胞与细胞之间的差异。然而，基因和表观遗传修饰展现的只是细胞的潜力。活细胞对其环境的快速、动态的响应更好地体现在增强细胞活力、增殖和与其它细胞沟通的代谢转变以及由此产生的小分子变化中。

纽黑文耶鲁公共卫生学院（Yale School of Public Health）分析化学家Caroline Johnson指出，代谢组与表型最直接相关，它揭示了基因组及其蛋白质输出量的产物，以及来自饮食、药物和有毒化合物的代谢物。

正因为代谢组学如此复杂，所以它的发展远落后于其它“组学”。与DNA和RNA不同，代谢物不能扩增。虽然部分代谢物可以达到毫摩尔浓度，但单个细胞能提供的、用于分析的体积非常小。检测更稀有的代谢物需要更敏感的方法，另外细胞内代谢物的浓度可能会在几秒之内发生巨大变化。人类代谢组数据库（Human Metabolome Database）包含超过42,000种代谢物的记录，这些代谢物包括糖、肽和辅助因子等。但事实上，代谢物种类远多于这个数，单一的分析方法很难检测多种化学分子。

然而，得益于检测能力的飞跃、分离和处理单细胞技术的日渐成熟，以及生物信息学的发展，代谢组学领域正在进步。来自伊利诺伊大学（University of Illinois）分析化学家Jonathan Sweedler表示，研究人员在不断进步，他们很快就能使检测单细胞代谢组学技术更加强大。虽然他并不清楚具体的工作机理，但他们现在看到质谱方法检测的分子种类和通量不断上升，他认为离这一天不远了。

 

提高灵敏度

Zenobi的团队分析了单个酵母细胞，结果发现遗传完全相同的两个细胞属于不同的表型——一类细胞中果糖1,6-二磷酸这种代谢产物水平很低，而另一类该产物水平很高。这种差异可能可以归结于不同的葡萄糖利用策略。Zenobi承认，这种发现并不能很快地应用到生物医学领域中，但它确实阐明了细胞工作的基本方式。

为了深入研究单细胞代谢组学，Zenobi的团队使用复杂的技术来分离细胞，并提高其分析方法的灵敏度。研究人员通常使用质谱或核磁共振（nuclear magnetic resonance, NMR）来开展代谢组学研究。但是因为NMR不太敏感，所以质谱法已经成为主要方法。另外，现在也有很多可以提高质谱的检测能力和通量，或简化提取单细胞代谢物的方法。Zenobi指出，整个质谱分析领域都在努力解决这些问题。

质谱需要使样本中各组分在离子源中发生电离，产生不同荷质比的带电荷的分子。这些分子经过加速电场的作用，进入质量分析器。在质量分析器中，在电场和磁场的作用下，每个分子根据其质荷比而产生不同的偏转量，使不同组分到达检测器的不同部位，形成质谱图。数据表现为未识别的峰，每个峰对应于不同的分子实体。

该方法很简单——只要不应用于单细胞。试图检测极小体积中的几个分子完全是突破了现代仪器的极限。

Zenobi使用专门的硅载玻片来把单个细胞递送到质谱仪中。肉眼看来，这种载玻片似乎被致密的黑色网所覆盖。玻片上涂覆有聚硅氮烷涂层，激光微加工后，该涂层上会产生数百至数千个存储空间，每个存储空间直径为几百微米。当研究人员将细胞的稀释溶液添加到载玻片上时，涂层的排斥性确保每个存储空间只会有一些液体和一到两个细胞。然后研究人员使用光谱仪的激光器依次瞄准每个孔，依次检测每个孔中细胞的代谢产物。这种质谱专用微阵列板可从Millipore公司购得。

Zenobi的研究生Robert Steinhoff演示了质谱仪如何检测这些微阵列。研究人员将飞行时间质量分析器（time-of-flight analyser）耦合到激光解吸/电离（MALDI）器上。为驱动电离，玻片上需要滴加一种化学基质，这种基质能最小化小分子释放的信号干扰。Zenobi的团队可以检测低至10^-18摩尔的代谢物，并且每个芯片可以检测1,000个细胞，这在单细胞领域，算得上高通量了。

Steinhoff也在不断改进驱动电离的化学基质。据他解释，使用纳米微柱能提高质谱法的灵敏度。尽管这种效应背后的机制还不太明确，但细胞最终会粘附在硅柱顶部。

Sweedler开发了一种高通量方法——使用计算机引导激光轮流照射每个细胞。Sweedler团队可以在每张玻片上检测1000个细胞。但是为了更全面地了解代谢组，Sweedler一次只读取分析一个细胞。他使用改进版本的膜片钳（一种常用于记录细胞电信号的工具），从个体脑细胞中提取大约3皮升的细胞质（细胞总体积的约10-40％），并将其递送到质谱仪中。

因为通量有限，每次试验只能检测几十个细胞。不过，Sweedler的研究小组已经使用这种方法，检测了来自大鼠脑切片中的30个神经元和星形胶质细胞的约60种代谢物。该团队专注于谷氨酸等神经化学物质，但也检测氨基酸和ATP的衍生物。之后，他们开始研究细胞的异质性。Sweedler表示，毕竟大脑非常复杂。

 

不同大小，不同处理

处理单细胞时，大小很重要。植物细胞大小在10至100微米之间。哺乳动物细胞更小，在10-20微米之间。微生物细胞更小，达到亚微米范围。随着细胞大小变化，细胞体积和代谢物的绝对量也有变化。乔治华盛顿大学（George Washington University）的化学家Akos Vertes指出，从分析角度看，没有一种方法可以处理这么小的体积。对不同大小的细胞，他们使用不同的方法来处理。

对于最大的细胞，他们使用尖锐的光纤将红外光直接传递到细胞中。光激发细胞内水中的氧—氢键，导致细胞炸裂，并喷射出胞内物质。随后，这些飞溅出的内容物遇到电喷雾——一种雾化的电离液体，它能对分子进行质谱分析。该技术的优点是可以对还存在于组织中的单细胞进行分析。但是Vertes指出该方法速度非常慢，因为每个细胞通常必须由“一位非常有耐心的研究生”使用光纤来戳破。他最近使用计算机操控，把这个过程自动化了。

最小的细胞沉积在硅制成的纳米柱涂层上。这个涂层虽然也是由硅制成，但是构造上与Steinhoff组使用的完全不同。接下来，通过对整个涂层成像，便可以揭示离子束应该在哪个位置靶向目标单细胞。使用这种方法，团队可以常规检测10^-15摩尔水平的代谢物。但研究人员估计，这种方法的检测下限约为800*10^-21摩尔，也就是482,000个分子。

但现在研究者们还能检测更小的细胞。瑞典哥德堡大学（University of Gothenburg）的生物分析化学家Andrew Ewing检测了神经囊泡内的小分子含量。这些囊泡在细胞之间传递和输送化学物质，可以促进细胞之间的交流。他指出，这很棘手，因为囊泡里分子很少，信息很少。

Ewing使用的是纳米级二次离子质谱法（nanoscale secondary ion mass spectrometry,  NanoSIMS），它能用高能量的铯离子束轰击样品表面。这种攻击会使样本表面喷射带电粒子，然后使用质谱仪分析分子组成。Ewing团队使用该方法来评估神经递质多巴胺的分布。通过将NanoSIMS的数据与透射电子显微镜相关联，研究者们可以观察单个囊泡在加载和卸载多巴胺时发生的变化。他们发现，囊泡的内部形状可以调节该过程发生的速度。

 

眼见为实

在日本大阪的RIKEN定量生物学中心（RIKEN Quantitative Biology Center），化学家Tsutomu Masujima使用视频记录了单细胞在质谱仪中发生的整个过程。

 

现在的技术已经可以提取并分析单细胞的胞浆。

 

 

Masujima认为个体细胞的行为非常有趣，并且出人意料，所以他喜欢尽可能多地看到这些细胞。Masujima的方法是，在视频观察下将纳米喷雾针直接插入细胞，吸出内容物，然后将内容物注射到质谱仪中。增加可视成分后，研究人员可以完成更精细的操作，例如捕获和分析单个白细胞和在血液中循环的肿瘤细胞的氨基酸和脂质含量。

使用这种方法，他的团队能够估计分子丰度。通常，这种看似简单的计算实际上十分复杂，因为研究人员不确定检测的样本体积有多少。因此，Masujima等人使用3D显微镜观察细胞被取样前后的体积差异，以此来推断取样的体积和部位。有一次，他们采集了甲硫氨酸亚砜这种胞质代谢物，确定他们捕获了5.9 *10^-21个分子。

 

解读数据

加利福尼亚州Scripps代谢组学和质谱技术中心（Scripps Center for Metabolomics and Mass Spectrometry）负责人Gary Siuzdak指出，幸运的是，生物信息学工具对理解这些数据有重要意义。

Siuzdak的中心运营着一个名为XCMS的基于云的在线代谢组学分析平台（表1），该平台上12,000多名用户共享了12万多个研究成果。Siuzdak承认，这些成果很少涉及单细胞，但这并不意味着它们与软件本质上不兼容。Siuzdak认为用生物信息学方法解读这些实验结果不成问题。

 

表1 代谢组学分析平台

名字	描述
人类代谢物数据库（Human Metabolo11me Database）	人体代谢物的免费数据库，包括化学分子概况、分子生物学和临床化学的相关细节。它可与通路数据库、结构数据库等其它数据库相连。
KEGG通路数据库（KEGG Pathway）	连接到一系列手动绘制的路径图数据库（KEGG数据库），具有定位和着色特定代谢物和途径的能力。
LipidBlast	用于脂质鉴定的串联质谱数据库。
MapMan	用于将大型数据集（如来自基因表达阵列的那些）转换为代谢途径图的工具。重点是植物代谢组学。
MetaboAnalyst	完成代谢组学数据处理和分析，包括质谱和核磁共振数据，以及常见的统计分析和热图可视化。
Metabolites Biological Role (MBRole)	集成来自一些化学和生物学数据库，以识别潜在重要的代谢物和其它分子的服务器。
MS-Dial	专门识别和鉴定质谱峰的可下载的程序。
OpenMS	专用于基于C++语言数据的分析和管理，包括用于软件开发的基础设施的开源库。主要用于处理原始数据。
XCMS Online	基于云的平台，用于原始液相色谱和质谱代谢物数据的分析和共享。
Yeast Metabolome Database	酵母代谢物及其化学性质的数据库，与光谱和化学数据库连接在一起。

 

相反，单细胞代谢组学的主要挑战是仪器：可以同时分析多个单细胞，并检测每个细胞中足够多的代谢产物，使结果具有统计意义的仪器。Siuzdak指出，单细胞的主要问题是硬件仍需要改进。现在的方法只能研究几十或上百个不同的分子。但是单个酵母细胞中的代谢物就超过600种。因此，即使是最敏感的分析技术，也只能检测细胞中最容易检测、最普遍的分子；不太常见的分子就无法被检测。

麦吉尔大学（McGill University）的计算生物学家Jianguo Xia表示，这一问题的可能解决方案可能就是基于人群的各种组学工具。基于大量细胞群得到的代谢组学数据是可以重复利用的。需要改进的可能只是数据处理和归一化方法的轻微修改。他还指出，单细胞转录组学已经建立起来了，我们可以从中学习，以加速单细胞代谢组学生物信息学的发展。

其他研究人员正在寻求质谱法以外的方法,尤其是活细胞法来研究单细胞。例如，Zenobi实验室的前博士后Matthias Heinemann， 现在在荷兰格罗宁根大学（University of Groningen）负责一个系统生物学小组。在那里，他利用自己在分析化学方面的背景，找到其它放大单细胞的方法。在一种方法中，他的团队使用荧光分子传感器来量化代谢物，例如ATP。在即将发表于《分子细胞》（Molecular Cell）论文中，他的研究小组使用延时显微镜观察细胞周期过程中ATP和另一种代谢物NADH（NADH具有自发荧光）的水平波动。

Heinemann指出，事实上现在已经解决了单细胞代谢组学领域的关键技术挑战。他承认，这个过程可能不是迷人的，现在需要做的是繁琐的开发和验证工作。但是单细胞代谢组学如果想要从概念证明到真正地解答生物学问题，这一步至关重要。

Masujima表示，人们经常很高兴能检测到独特的分子，但他的观点是：为什么？这个发现背后的是什么，这个分子的作用是什么？若没有这种洞察力，技术就并不能真正地解决生物学问题。他可不想成为一个做这种科学的科学家。