蛋白质的磷酸化是指由蛋白激酶（protein kinase, PK）催化的把 ATP 或 GTP γ 位的磷酸基转移到底物蛋白质的氨基酸残基上的过程。其逆转过程是由蛋白磷酸酶（protein phosphatase, PPase）催化的，称为蛋白质的脱磷酸化（去磷酸化）（图2）。作为一种基础修饰类型，蛋白质的磷酸化和去磷酸化几乎在每个生物的各个方面都扮演着重要的角色，例如基因转录、表达、细胞增殖、分化、凋亡、信号转导、免疫调控、肿瘤发生等。
图2 蛋白质磷酸化反应示意图[1]
生物体内磷酸化位点主要发生在 Ser（丝氨酸）、Thr（苏氨酸）、Tyr（酪氨酸）残基上，其中 Ser 磷酸化最多、Thr 磷酸化次之、Tyr 磷酸化最少。另外，His（组氨酸）、Asp（天冬氨酸）和 Lys（赖氨酸）残基也可能被磷酸化。蛋白的磷酸化修饰是一种可逆修饰，蛋白激酶可催化蛋白发生磷酸化，而去磷酸化的逆过程是由蛋白磷酸酶催化的。人类样本中已经证实的磷酸激酶有500多种，拟南芥中预测的磷酸激酶有1000余种。以乙醇基作为受体的磷酸转移酶称为蛋白丝氨酸或苏氨酸激酶，以苯基为受体的磷酸转移酶称为蛋白酪氨酸激酶。很多癌症研究中，都发现了蛋白激酶抑制剂作为癌症治疗药物的巨大价值，比如慢粒白血病的特效药“格列卫”就是一种酪氨酸酶抑制剂，靶向抑制肿瘤细胞中异常激活的酪氨酸激酶。目前磷酸化蛋白主要通过特异性抗体结合 Western Blot ，酶联免疫吸附分析（ELISA），细胞内流式细胞术和免疫细胞化学/免疫组织化学（ICC/IHC）以及质谱等方法进行检测。基于质谱的磷酸化蛋白质组具有高分辨、更全面等优势，但由于磷酸化修饰的蛋白质在生物样本中含量低且动态范围广，检测前需要对发生修饰的蛋白质或肽段进行富集。因此如何提高磷酸化肽段富集时的选择性、灵敏度、富集效率具有重要的研究价值，目前富集磷酸化肽段的技术分支有很多，比如：免疫共沉淀法（采用抗体富集）、固相金属亲和色谱（IMAC）、金属氧化物亲和色谱法（MOAC）等。不同技术各有优缺点，目前应用比较广泛的富集方法是 IMAC 的 IMAC-Fe 与 MOAC 的 TiO2。IMAC-Fe 是利用磷酸化基团与固相化的 Fe3+金属离子的高亲和力来富集磷酸化多肽的。
蛋白质的磷酸化和去磷酸化是调节和控制蛋白质活力和功能的最普遍、也是最重要的调控机制，具有重要的研究价值，广泛应用于微生物、植物和动物的研究中。磷酸化参与各种生理和病理过程，调控细胞的增殖、分化和凋亡，广泛运用在信号转导、信号通路、细胞凋亡、发育分化、癌症机理等研究领域，下面就几个研究比较多的方向进行简单总结。
信号通路一般依赖信号蛋白上磷酸基团的传递。某蛋白在磷酸激酶的作用下，将磷酸集团传递给下游蛋白（可能是转录因子或下游激酶），使其发生磷酸化，同时上游激酶又激活该蛋白的磷酸化，形成多级激酶模式，实现信号的级联放大。磷酸化蛋白质组可测得信号通路上高表达的磷酸化蛋白，进而找到表型相关的激活信号通路，解释相关机理。例如：通过磷酸化蛋白质组学技术，分析体内 GPCR（G蛋白偶联受体）信号通路中磷酸化蛋白及磷酸化位点，系统性地了解阿片类药物对大脑的影响，有助于针对性地干扰级联信号，减弱或消除药物副作用[3]。
蛋白激酶可以通过影响信号通路上的蛋白的磷酸化，调节细胞的生长分化以及凋亡。例如，以裂殖酵母为研究模型，通过抑制剂处理，检测不同细胞分裂时期酵母中的磷酸化蛋白质组，发现 CDK（周期蛋白依赖性激酶）对细胞分裂的影响是通过酶活阈值和底物特异性共同调控的[4]。
3）植物的抗逆、抗胁迫
在生物和非生物胁迫下，植物可以通过信号通路上蛋白的磷酸化或去磷酸化调节生长发育和胁迫应答之间的平衡，从而使植物具有一定的抗逆性。例如，磷酸化蛋白质组学发现植物雷帕霉素靶蛋白（TOR）激酶和脱落酸（ABA）受体偶联的信号通路之间的磷酸化修饰作用，证明了植物利用这种保守的磷调节反馈机制来平衡生长发育和胁迫应答[5]。
图7 植物通过 TOR 激酶和 PYL 蛋白磷酸化平衡生长发育和胁迫应答的模式图磷酸化蛋白质组图谱对于肿瘤的分子分型、致病机制研究和治疗靶点选择，都有着非常重要的研究意义。在肿瘤的大样本量队列研究中，磷酸化蛋白质组结合定量蛋白质组技术，可以对一些常见癌症进行更精确的分子分型。在肝癌、乳腺癌中已有相应报道，例如，对159位 HCC（肝癌）病人的配对癌组织和癌旁肝组织进行多组学研究，在磷酸化蛋白质组部分，对差异表达的磷酸化蛋白进行通路富集，将肿瘤队列分型，得到三种预后不同亚型[6]。
图8 差异磷酸化蛋白的功能富集及不同亚型的预后情况
肿瘤组织中，某些磷酸化蛋白很可能本身是抑癌因子或者致癌因子，例如，对大样本量结肠癌的癌及癌旁组织进行蛋白质组学和磷酸化蛋白质组学队列研究，发现结直肠癌中Rb蛋白的磷酸化可以促进细胞增殖，减少细胞凋亡，解释了这种经典肿瘤抑制因子在结肠肿瘤中被扩增的原因[7]。
图9 磷酸化的 Rb 蛋白作为结肠癌治疗靶点的潜在机理
肿瘤组织中的磷酸化蛋白或蛋白激酶也可作为癌症的治疗靶点，例如，对于不同预后情况的三阴性乳腺癌（TNBC）癌组织进行磷酸化蛋白质组研究，发现了一组六种激酶驱动复发性 TNBC 的磷酸基序，在临床模型中，通过六种激酶的抑制剂治疗，发现靶向这些激酶的潜在治疗效用[8]。
图10 磷酸激酶抑制剂的治疗效果
5）昼夜节律
蛋白磷酸化通过影响转录调控，细胞周期，代谢过程等，影响生物的昼夜节律，揭示了生物钟的规律和内在调节机制，例如：对不同时间节点的小鼠肝脏取样进行磷酸化蛋白质组检测，发现小鼠肝脏磷酸化蛋白的表达水平每天大幅度振荡，PCA 分析可以将磷酸化肽段分为昼、夜两大类，且周期性变化的磷酸化蛋白功能符合生物活动和进食规律[9]。
图11 磷酸激酶网络和信号通路的时间调控情况
小编总结：
蛋白的磷酸化修饰作为一种基础修饰，普遍存在于动物植物和微生物中，由于影响信号转导、细胞周期、分化发育等各个方面，已经在生长发育、抗逆、癌症等领域得到了广泛的研究。
