化合物Ochrephilone在制备抗结核病药物中的应用的制作方法（专利）

化合物Ochrephilone在制备抗结核病药物中的应用的制作方法 【专利摘要】本发明属于生物学领域，具体涉及化合物Ochrephilone在制备抗结核病药物中的应用。化合物Ochrephilone属于嗜氢酮天然霉素家族。本发明通过研究发现，化合物Ochrephilone具有有效抑制结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G自我磷酸化的活性，因此，Ochrephilone可用于制备以结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G为靶点的新的抗结核病药物。 【专利说明】化合物Ochrephi I one在制备抗结核病药物中的应用 【技术领域】 [0001]本发明属于生物学领域,具体涉及化合物Ochrephilone在制备抗结核病药物中的应用。 【背景技术】  [0002]结核病是由结核分枝杆菌引起的慢性传染病，根据世界卫生组织从204个国家收集到的最新数据，结核病仍是目前威胁人类的一个主要传染病杀手。《2012年全球结核病控制报告》中指出，2011年全球新增结核病患者870万人，全球死于结核病的人数为140万人。在中国，受结核分枝杆菌感染人数甚至超过5.5亿，如果不采取有效的控制措施，在未来10年内，我国可能有近5000万的感染者发生结核病。目前临床上用于治疗结核病的有效药物少，治疗周期长，对人体毒性大，同时耐药性的菌株频频出现，使得新型安全高效的抗结核药物开发迫在眉睫。 [0003]结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G是一种类真核蛋白激酶，可溶性的细胞质蛋白，无跨膜结构域，750个氨基酸，分子量约为82KDa。它的结构包括氨基端的硫氧还蛋白结构域，中间激酶催化活性结构域和羧基端的四肽重复序列结构域。激酶催化结构域本身没有催化活性，需要两端的结构域的调控作用，氨基端的硫氧还蛋白结构域中的半胱氨酸可以调节PKnG的氧化还原状态，体外实验鉴定氨基端的Thr63是主要的磷酸化位点。 [0004]结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G是结核分枝杆菌在感染宿主细胞后，分泌到宿主细胞内的蛋白。结核分枝杆菌被宿主细胞吞噬后形成吞噬体，通过阻止吞噬体与溶酶体的的融合，从而不被溶酶体降解，此时的结核分枝杆菌代谢活动降到最低，生长繁殖几乎停止，不易被抗菌药物杀灭，当机体免疫力降低时，结核分枝杆菌又继续生长繁殖，恢复致病力。结核分枝杆菌这种“持留”状态的形成机制目前研究的不是很清楚，但已有实验证实PKnG在阻止结核分枝杆菌到溶酶体的转运过程中发挥着重要的作用，其中PKnG氨基端的73个氨基酸,硫氧还蛋白结构域以及Thr63在调节PKnG介导的结核分枝杆菌在宿主细胞内的存活是必需的。PKnG成为可能的抗结核病药物的靶点之一，并以其抑制剂筛选抗结核病药物，有助于新型、安全、高效特异的天然活性提取物药物的研发，有利于结核病的控制甚至根除。  【发明内容】  [0005]本发明的目的是为了克服现有技术中缺乏有效抗结核病药物的缺陷，提供一种化合物在制备抗结核病药物中的应用。 [0006]本发明通过以下技术方案实现上述目的。 [0007]本发明通过研究发现,化合物Ochrephilone具有有效抑制结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G自我磷酸化的活性，因此，本发明提供化合物Ochrephilone在制备抗结核病药物中的应用。 [0008]本发明同时还提供化合物Ochrephilone在制备结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G抑制剂药物中的应用。 [0009]具体地，所述药物为抑制结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的自我磷酸化的药物。 [0010]本发明所用的化合物Ochrephilone是从海洋微生物中分离得到的天然代谢活性产物,化合物Ochrephilone的具体分离方法可具体参考文献(肖碧红，佘志刚，雷晓凌，等.南海沿海海藻内生真菌ZJ27次级代谢产物研究[J].中药材，2011，34(4):544-546.),其分子结构式如式(I )所不。化合物Ochrephilone还可以通过其他方法制备得到，无论哪种方法得到的化合物Ochrephilone的结构式都是一样的，所以其功能都是一样的。所以化合物的来源对本发明不做任何形式的限定。 [0012]本发明同时提供了一种抗结核病药物,所述药物含有Ochrephilone或其药学上可接受的盐或衍生物。该药物还可以与已知的抗结核药物同时使用。该药物也可含有药学上可接受的载体和/或赋形剂。 [0013]本发明首次发现，Ochrephilone可以以结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G作为靶点，抑制该蛋白的自我磷酸化作用。 [0014]所述的结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G基因的多核苷酸，具有SEQ IDNO:1所示的序列，其在基因文库中登录号为:NC_000962.3。 [0015]本发明所述的结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G是使用重组技术从原核宿主中产生。其具体制备方法包括如下步骤: (1)利用PCR扩增法、重组法或者人工合成方法获得编码SEQID N0:1所述结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的多核苷酸； (2)将多核苷酸片段克隆并转导或者转化进合适的宿主细胞； (3)在合适的培养基中培养宿主细胞； (4)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。 [0016]本发明通过以下方法步骤研究化合物Ochrephilone对于结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的抑制作用: 1.结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的制备方法: (I)结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G编码序列的获得:以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板，PCR克隆丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G基因。结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G编码序列全长2253个碱基对，含有编码结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的750个氨基酸残基的序列，其DNA及其编码的氨基酸残基序列见序列表(SEQ IDNO:1 和 SEQ ID NO:2)。 [0017](2)结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G编码序列的克隆与表达:按常规分子克隆方法，将PCR扩增的结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G编码基因片段克隆至大肠杆菌的表达载体pET28a(+)中，所得的表达质粒称为pET28a(+)-PKnG。pET28a(+)为长度5369bp双链环状DNA质粒，在多克隆位点上游的调控区内含有噬菌体T7启动子，受T7RNA聚合酶的诱导而启动其下游基因的转录，该质粒含有一卡那霉素抗性基因，可转化以大肠杆菌BL21(DE3)为代表的一系列宿主细胞； 用pET28a(+)-PKnG表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，并筛选出表达PKnG的表达株，称为E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-PKnG。在LB培养基中呈可溶性高表达重组基因目的蛋白-结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G。 [0018](3)结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的纯化:通过发酵培养带来有结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G基因片段的重组表达质粒的大肠杆菌工程菌E.coliBL21 (DE3)/pET28a(+)-PKnG，可获得大量的结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白，经过一些成熟的纯化步骤，如镍螯合琼脂糖凝胶亲和层次、超滤等的结合应用，可获得成分均一的具有高纯度(95%)的结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G。 [0019]2.结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G酶活性的检测方法:采用ADP高通量激酶检测试剂盒ADP-Glo ? Kinase Assay Kit (Promega公司产品)，对重组结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G进行酶活分析。 [0020]3.0chrephilone的作用祀点的验证方法: (1)利用上述ADP高通量激酶检测试剂盒验证化合物对结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的抑制酶活性； (2)利用分子对接软件SYBYLX进行生物信息学分析,模拟Ochrephilone与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G相互作用； (3)利用荧光光谱验证化合物与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G相互作用； (4)利用圆二色谱验证化合物与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G相互作用； (5)利用微量热泳动仪测量化合物与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的化学结合常数。 [0021]本发明抑制结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G活性的分析方法，采用ADP-1o ?激酶检测试剂盒对重组结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G进行酶活分析。 [0022]由上述测定方法发现:化合物Ochrephilone对结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的酶活抑制活性，其IC5tl为63.7uM。 [0023]利用分子对接软件SYBYL X进行生物信息学分析,模拟Ochrephi1ne与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的相互作用。软件分析结果显示，得分值分别为4.9767 ； 利用荧光光谱验证，化合物与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G相互作用；利用圆二色谱验证，化合物与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G相互作用；利用微量热泳动仪测量化合物与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的化学结合常数，解离常数Kd分别为4980nM±317nM。 [0024]与现有技术相比本发明具有以下有益效果: 本发明通过研究发现化合物Ochrephilone,以结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G为作用靶点，能够有效抑制结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G活性，具有结核病治疗的临床应用前景和潜力，同时为结核病的治疗开创了一条新的有效途径。【专利附图】  【附图说明】 [0025]图1为从结核分枝杆菌H37Rv基因组中PCR扩增PKnG基因片段电泳检测图； 其中M为核酸标准分子量(fermentas 1000bp plus DNA ladder), I为2253bp的结核 分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G基因片段。 [0026]图2为结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的重组质粒构建流程图。 [0027]图3为琼脂糖凝胶电泳检测转化子的菌落PCR鉴定电泳图； 其中M为核酸标准分子量(fermentas 1000bp plus DNA ladder), K为空白对照，I~6分别为2253bp的结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G基因片段。 [0028]图4为琼脂糖凝胶电泳检测转化子的双酶切鉴定电泳图； 其中 M 为核酸标准分子量(fermentas IOObp plus DNA ladder), I 为 Nde I 和 Xho I双酶切重组质粒，2为Nde I和Xho I双酶切质粒。 [0029]图5为不同诱导剂IPTG浓度的重组菌超声破碎后融合蛋白SDS-PAGE分析； 其中，M为蛋白质分子量标准(fermentas，SM0661), I为未加IPTG诱导对照，2、分别 为不同 IPTG 浓度(0.lmM、0.2mM、0.3mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.7mM、0.8mM)，诱导 6h，重组 子表达融合蛋白情况。重组菌均表达相对分子量为82kDa的融合蛋白，即图内箭头所示的位置。 [0030]图6为表达带组氨酸标签的结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白重组菌诱导温度，诱导时间优化的SDS-PAGE分析结果； 其中M为蛋白质分子量标准(fermentas，SM0661)，I为未加IPTG诱导对照，2~4分别为不同温度(201:、301:、37°0，0.2mM IPTG浓度，诱导6h，重组菌体超声破碎后的融合表达蛋白情况，5~7分别为不同诱导时间(4h、6h、8h)，0.2mM IPTG浓度，重组菌体超声破碎后的融合表达蛋白情况，重组菌均表达相对分子量为82kDa的融合蛋白，即图内箭头所示的位置。 [0031]图7为不同浓度咪唑洗涤洗脱融合蛋白的SDS-PAGE分析； 其中M为蛋白质分子量标准(fermentas，SM0661)，1为未加IPTG诱导对照，2为加入IPTG诱导菌体超声破碎后总蛋白，3为加入IPTG诱导菌体超声破碎上清液，4为加入IPTG诱导菌体超声破碎沉淀，5为高浓度咪唑350mM洗脱纯化蛋白PKnG，6为50KDa超滤管浓缩 纯化蛋白。 [0032]图8为通过Western blot方法检测纯化后的结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白的结果； 其中I为未诱导重组菌体对照，2为诱导表达重组菌融合蛋白表达分析，重组菌能够表达融合蛋白，且条带大小符合预期。 [0033]图9为OchrephilonelOOuM时对结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G酶活的抑制筛选图。 [0034]图10为Ochrephilone对结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的抑制酶活性的IC50测定曲线。 [0035]图11为分子对接软件模拟Ochrephilone与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G相互作用。[0036]图12为结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G生色氨基酸分布分析。 [0037]图13为25°C时不同浓度化合物Ochrephilone与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白相互作用的荧光发射光谱图； 其中 a~j 分别为不同浓度 Ochrephilone (O μ g/ μ L、0.0003 μ g/ μ L、0.0006 μ g/ μ L、0.0010 μ g/μ L、0.0013 μ g/μ L、0.0016 μ g/μ L、0.0023 μ g/μ L、0.0033ug/uL、0.0050ug/uL、0.0067ug/uL)与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白相互作用的突光发射光谱曲线。 [0038]图14为25°C时不同浓度比的DMSO与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白相互作用的荧光发射光谱图； 其中 a~j 分别为不同体积 DMSO (0μ L、0.1 μ L、0.2 μ L、0.3 μ L、0.4 μ L、0.5 μ L、0.7 μ L、l.0uL、l.5uL、2.0uL)与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白相互作用的荧光发射光谱曲线。 [0039]图15为25°C时不同浓度化合物Ochrephilone与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白相互作用CD光谱图； 其中 a~h 分别为不同浓度 Ochrephilone (O μ g/ μ L、0.004 μ g/ μ L、0.008 μ g/ μ L、 0.012 μ g/μ L、0.016 μ g/μ L、0.020 μ g/μ L、0.024 μ g/μ L、0.028ug/uL)与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白相互作用的CD光谱图曲线。 [0040]图16为25°C时不同浓度比的甲醇与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白相互作用的CD光谱图； 其中 81分别为不同体积甲醇((^1^、1.(^1^、1.5 4 1^、2.(^1^、2.5 4 1^、3.(^1^)与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白相互作用的CD光谱图。 [0041]图17为微量热泳动法测定Ochrephilone与结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的解离常数； 其中A为热泳动前进行毛细管扫描，B为微量热泳动信号曲线，C为解离常数Kd拟合曲线，D为热泳动分析后进行毛细管扫描。 【具体实施方式】 [0042]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。 [0043]实施例中所用的化合物Ochrephilone是从海洋微生物中分离得到的天然代谢活性产物,化合物Ochrephilone的具体分离方法可具体参考文献(肖碧红，佘志刚，雷晓凌，等.南海沿海海藻内生真菌ZJ27次级代谢产物研究[J].中药材，2011，34(4):544-546.),化合物Ochrephilone还可以通过其他方法制备得到,无论哪种方法得到的化合物Ochrephilone的结构式都是一样的，所以其功能都是一样的。所以化合物的来源对本发明不做任何形式的限定。 [0044]实施例1结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G蛋白的融合表达及纯化。 [0045]S1.结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的基因克隆，按照如下步骤进行:以酚氯仿抽提法提取了结核菌H37Rv基因组DNA，根据已知结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G基因序列设计并合成引物，在上、下游引物上5’端分别加上Nde I和Xho I酶切位点，PCR克隆pkng基因，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果扩增出2253个碱基对长的结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的DNA片段(见图1)。电泳回收(从琼脂糖凝胶内回收DNA片段的试剂盒为Omega公司产品)，纯化扩增的基因片段，溶于30 μ I的去离子水中，-20°C保存。 [0046]S2.表达结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G表达载体的构建:提取质粒pET28a(+)，用Nde I和Xho I双酶切(限制性内切酶Nde 1、Xho I为fermentas公司产品)，电泳后回收酶切的质粒大片段，溶于30μ I的去离子水中。用Nde I和Not I双酶切结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G基因片段，其5’端和3’端分别形成粘性末端，电泳回收后溶于去离子水中。取上述酶切后DNA片段，按质粒载体:基因片段为3:1的摩尔浓度比例混匀，在同一离心管内用T4DNA连接酶(T4DNA连接酶NEB公司产品)连接(室温2小时)。使PKnG的基因片段插入到载体pET28a(+)(表达载体pET28a (+)为美国Novagen公司产品)内的Nde I和Xho I位点之间，重组质粒构建流程图见图2。 [0047]S3.重组质 粒转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞与筛选:上述连接的重组质粒转化大肠杆菌DH5a (宿主菌DH5a为美国Novagen公司产品)，转化产物涂布含卡那霉素(50μ g/ml)的固体LB培养基上，置37°C培养过夜。次日观察平板细菌生长状况，挑取大的白色单菌落进行patch，做好记号，37°C培养过夜。对patch方块进行菌落PCR。取PCR产物5 μ 1，用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测(见图3)。选取有目标2253bp片段的菌落接种至含有5ml含有卡那霉素(50μ g/ml)的液体LB培养液的试管中，做好标记，37°C 220r/min振荡培养过夜。按质粒提取试剂盒要求提取阳性转化子的质粒(试剂盒为Omega公司产品)。对从转化子中提取所得的质粒用限制性内切酶进行Nde I和Xho I双酶切验证，琼脂糖凝胶电泳分析有2253bp的一条带，而对照组未重组质粒没有出现这条带(见图4)，将质粒送去测序公司测序,结果基因序列正确。 [0048]S4.表达结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白的纯化: S41.构建结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G表达载体pET28a(+)-PKnG。然后将表达载体转化到大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，并诱导表达结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G。 [0049]S42.重组蛋白PKnG表达条件的优化:将得到的表达结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白工程菌接种到5ml含有卡那霉素(50 μ g/ml)的液体LB培养液的试管中，37°C振荡培养过夜。接着分别摸索诱导剂IPTG浓度、诱导温度、诱导时间对蛋白产量的影响。按1:100的比例将上述培养物转接于含50 μ g/mL卡那霉素的新鲜LB培养基中，370C 200rpm振荡培养至0D600=0.6左右。IPTG浓度优化:向培养物中加入IPTG至终浓度分别为0.lmlT0.8mM,继续振荡培养4小时；诱导温度优化:向培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mM，分别于37°C，30°C和20°C继续振荡培养5小时；诱导时间优化:向培养物中加入IPTG至终浓度为0.2mM,于37°C分别继续振荡培养4小时、6小时和8小时。离心收集菌体，超声破碎，对超声破碎的沉淀和上清分别进行SDS-PAGE检测，电泳检测结果显示(见图5、6)，最佳的蛋白诱导条件为当菌体浓度为0D600为0.5-0.6时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，20°C诱导过夜表达。 [0050]S43.重组蛋白PKnG的提取纯化:将培养的表达结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白工程菌离心(5000Xg,5min,4°C),弃上清，菌体重悬于8ml的裂解缓冲液中(25mMTris, 20mM 咪唑，500mM NaCl, pH7.4),并加入 100 μ I Triton Χ-100，50 μ I ImM巯基乙醇，2ml蛋白酶抑制剂，冰浴超声lOmin，离心(12000rpm，20min，4°C )，收集上清。利用镍螯合琼脂糖凝胶亲和层析纯化:首先装柱子将镍螯合琼脂糖凝胶(GE公司产品)装入到层析重力柱(NEB公司产品)，先用裂解缓冲液(25mMTris，20mM咪唑，500mMNaCl，pH7.4)冲洗平衡，然后将上步获得的裂解上清直接上样，混匀，于4°C，在翻转摇床上摇30min，以便蛋白组氨酸标签与镍离子结合。收集流出的穿流峰蛋白，然后依次用含不同浓度咪唑的缓冲液进行阶段洗脱，收集各洗脱峰蛋白，用10%SDS-PAGE检测穿流峰和各洗脱峰蛋白，确定那个组分内含有融合蛋白。通过实验结果分析最终决定蛋白纯化浓度分别为清洗缓冲液(25mMTris, 50mM 咪唑，500mM NaCl, pH7.4)，洗脱缓冲液(25mMTris, 350mM咪唑，500mM NaCl, pH7.4)，蛋白保存缓冲液(25mMTris，pH7.4)，将350mM咪唑洗脱蛋白加入到滤膜孔径为50kDa的超滤管中，5000Xg，4°C离心15min脱盐浓缩，弃去超滤管管底的液体，加入适量蛋白保存缓冲液(25mMTris，pH7.4)或PBS将洗脱蛋白的咪唑置换，离心直到滤膜上的液体少于2ml，即可用于后续操作(见图7)。纯化蛋白保存于4°C。采用Bradford蛋白检测试剂盒(Bio-Rad公司产品)测定PKnG浓度。 [0051]S44.蛋白质印迹法鉴定纯化蛋白:超滤纯化结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白的SDS-PAGE:取5 μ I纯化超滤浓缩的合适浓度结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白，与2 μ I的上样缓冲液(Thermo公司产品)混匀，沸水浴或金属浴lOmin，冷却后离心即可上样。剪取大小合适的滤纸和PVDF膜，分别浸泡在转膜缓冲液及甲醇中，使两者充分浸润。按顺序将滤纸、PVDF膜、SDS-PAGE胶放入转膜槽，恒定电流200mA，时间2小时。将膜取出放入封闭液中，室温封闭2小时。弃去封闭液，TBST清洗膜3次，每次5min。以合适稀释度(1:3000)的鼠抗组氨酸标签(Sigma公司产品)为一抗，4°C孵育过夜。用适量的TBST清洗膜3次，每次5min，二抗室温孵育1.5小时，二抗为辣根过氧化酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体 (PTG公司产品)。TBST洗膜3次后即可用于化学印迹发光检测，按1:1的比例混合化学发光底物A液和B液，将其均匀滴到膜上，启动软件进行曝光并拍照(图 8)。 [0052]实施例2化合物Ochrephilone对结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的抑制酶活性分析 采用ADP高通量激酶检测试剂盒ADP-Glo ? Kinase Assay Kit (Promega公司产品)进行化合物抑制结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的酶活分析，所用的结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G是实施例1得到的重组结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白。在200ulPCR管内加入一定量试剂盒中纯的ATP、激酶反应溶液、重组结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G，室温孵育20min，同时准备阳性对照、阴性对照和空白对照孔，本实施例所用抑制结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G活性的阳性对照为AX20017,阴性对照为DMS0、ATP、结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G融合蛋白，空白对照只加入DMS0、ATP，实验设计详见表1。孵育结束后，取5uL激酶反应溶液至新的已经加入5uLADP-Glo ?试剂PCR管中，编号，ADP-Glo ?试剂终止激酶反应，并且除去体系中剩余的ATP,反应一定时间之后加入试剂盒中的激酶检测试剂10uL，激酶检测试剂将反应体系中生成的ADP转化为ATP，使用偶联的萤光素酶/萤光素反应检测新合成的ADP的含量，反应一定时间之后将总体积20uL的PCR管内的溶液转移到384孔白板平底内，通过多功能酶标仪读出每个孔内的荧光读值。根据荧光读值按照一下计算方法算出各种化合物对结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G酶活的抑制率:抑制率(％)=(实验组-空白组)/(阴性对照组-空白组)。 [0053]初始筛选时规定反应体系中，各种化合物的终浓度为IOOuM,结果用柱状图表示，横坐标表示不同的化合物，纵坐标为化合物对PKnG的酶活抑制率(见图9)。接着对初筛出来的具有较好酶活抑制的化合物(Ochrephilone)进行IC5tl的测定，以化合物浓度的对数为横坐标，酶活抑制率为纵坐标作图(见图10)，由Origin pro 8软件拟合曲线和计算出IC5(I，测出化合物Ochr印hi1ne的IC50值分别为63.7 μ M0 [0054]表1化合物对结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的抑制酶活性分析体系表 【权利要求】 1.Ochrephilone在制备抗结核病药物中的应用。 2.Ochrephilone在制备结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G抑制剂药物中的应用。 3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述药物为抑制结核分枝杆菌丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶G的自我磷酸化的药物。 4.一种抗结核病药物，其特征在于，含有Ochrephilone或其药学上可接受的盐或衍生物。 5.如权利要求5所述的药物，其特征在于还含有传统抗结核病药物。 6.如权利要求5所述的药物，其特征在于还含有药学上可接受的载体和/或赋形剂。 【文档编号】A61K31/365GK103735542SQ201310712030 【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日  【发明者】陆勇军, 马双双, 佘志刚, 李翰祥, 牛长红, 何磊 申请人:中山大学。