高通量测序（NGS）抗体制备原理以及在临床诊断中的应用

自从1796年，EdwardJenner发现了第一个疫苗后，疫苗已经成为世界上最重要的公共健康干预方法之一，疫苗的使用有效的降低感染性疾病的风险，每年阻止了数百万人的死亡。大多数得到许可的疫苗都是通过促进B细胞来产生抗体保护机体免受感染性疾病的侵害，但是获得一个拥有较好的免疫效应的天然抗体是很难的。

近几年出现的高通量测序技术可以对抗体库进行高质量的特性分析，同时也可以分析疫苗免疫前后机体的抗体库的变化。这种利用高通量测序分析抗体库的方法也提高了利用特异性抗体序列来评估疫苗免疫效应的概率。

抗体库以及高通量测序

B淋巴细胞在特定抗原的刺激下，能够分化、增殖形成具有针对这种抗原分泌特异性抗体的能力。人体里分布的拥有不同的重链重排的B细胞的数量大概至少为106个，尽管理论推断每个成年人至少应该有1011个B细胞来产生抗体。

最初机体的抗体多样性是由在B细胞的成熟过程中多个V（可变区片段）基因和D（高变区）基因以及连接基因（J）片段的体细胞重组形成有功能的VL以及VH，并且通过在连接处减少或者增加P和N核苷酸来增加抗体多样性。随后在一个新抗原入侵时，机体会对抗原发生反应，在这期间通过几轮的的体细胞高突变进一步增加了VH/VL的多样性，最终选择在胚系基因中心提高抗原结合能力的B细胞。不同抗体又拥有不同的抗原表位，这种抗体抗原表位的多样性是识别潜在的病原的重要因素。

所有的体内循环的抗体的总数被称为抗体库。每个个体的抗体库可能由很多不同的因素决定，包括他们的基因型和染色体结构、个人年龄差别以及抗原接触历史等。对抗体库的研究将会为临床疾病诊断、愈后追踪和治疗方法的选择提供便利的条件。但是抗体库多样性的数量是惊人的，如果考虑到工作量和花费问题，利用传统的测序方法去分析这样大量的抗体库多样性是不切实际的。

近几年出现的NGS测序技术，又称二代测序技术，能一次并行对几百万条DNA分子进行序列分析，通过NGS测序平台得到的大量测序数据非常适合用于像抗体库这样多样化基因片段的复杂集合的全面分析。对抗体库的高通量测序分析更能准确的反映抗体基因频率以及体细胞突变模型。

当设计一个对抗体库高通量测序的实验时，我们第一个问题便是测什么？尽管很多问题需要对整个抗体可变区进行测序，但是高通量测序的平台对测序的长度是有要求的，完整的抗体序列无法测序，如果将序列打断成小片段测序后在拼接就会出现很多人为误差。考虑到最初鉴定抗体时，仅仅只是通过确定CDR3区来鉴定可变区基因序列的，这就表明同样的CDR3序列经常在拥有不同CDR1和CDR2的多个可变区基因中使用。这很可能是体细胞基因转化造成的，在V(D)J重排后，第二次的基因重排主要发生在V基因片段的上游和已经重排的V(D)J基因中。所以高通量测序可以只对可变区的CDR3区进行测序，CDR3序列可以被当作淋巴细胞来源的抗体的的编号，以其读长更短以及更高的通量可以被有效的测序。

除此之外，如何从高通量测序得到的庞大数据中得到我们需要的抗体序列呢？首先，是基于数量策略：如果一个抗体序列在抗体库中出现频率特别高，就有可能具有特殊功能。Reddy等人就是从免疫后的小鼠骨髓淋巴细胞中挑选了频率最高的抗体序列表达得到抗原特异性抗体。其次，是基于序列标签策略：当在序列的一致性比较高的情况下，已知抗体序列的独特性也可以被用来调取拥有相似的抗原识别位点的抗体。最后是基于系统进化的策略：系统进化历程相似的序列经常表明蛋白之间有功能相关性。Wu等人就是通过利用系统进化历程的关系比较已有的一类VRC01抗体序列，发现这些序列在系统发育上都是相近的。同样的，zhu等人利用系统进化分析的方法，从一个未知VRC01类型的新患者体内发现了一种新的VRC01类型并制备得到高亲和力的抗体。

NGS测序技术在抗体发现和疾病鉴定中的应用

利用高通量测序技术对抗体库进行分析，可以使我们对免疫系统有更新的认识，并且在临床诊断、抗体药物的发现以及疫苗的制备方面都有很大的意义。

NGS测序技术在抗体制备中的应用

杂交瘤技术是最初制备单克隆抗体的方法，而随后出现的体外展示技术是目前制备人源化单抗的主要方法，它主要通过核糖体、噬菌体等展示文库筛选得到大量的能够识别特定的抗原表位或构型的抗体。展示文库筛选抗体包括连续几轮淘洗，这种筛选过程可以逐渐从多样性的抗体库中筛选出较少的所需要的高亲和力和特异性高的的抗体克隆。然而，在展示文库筛选的过程中，由于一些表达高质量的抗体克隆会对编码它们的细胞的生长产生不利的影响，因此它们竞争不过那些快速生长但表达低质量抗体的克隆，所以在淘洗的过程中，有一些我们希望留住的抗原结合能力强的编码抗体的克隆会被筛选出去，但是高通量测序技术与噬菌体展示技术联合使用，对抗原筛选了一轮或者两轮的展示文库进行序列分析，通过高频出现的序列配对合成产生抗体，这种方法就可以得到那些在展示文库的筛选过程中未被发现的但能够编码高亲和力的抗体。Saggy等利用蛋白免疫小鼠后分离得到B淋巴细胞，利用高通量测序和噬菌体展示文库两种技术分别制备抗体，将两种技术分别制备的抗体作对比，发现高通量测序制备的抗体对抗原的特异性更高，除此之外，噬菌体展示技术制备的抗体的多样性较低，一些高通量测序得到的可溶性抗原特异性的抗体在噬菌体展示技术中并未出现，因此，这两种方法可以相互辅助来制备不同的抗原特异性抗体。除此之外，Zhu等利用高通量测序技术对HIV患者血清中的广谱中和性抗体的VH和VL进行深度测序，对得到的数据进行系统进化树分析，发现在系统进化树的相对应的分支上配对后的VH和VL能够产生高亲和力的特异性抗体。这种利用高通量测序技术构建系统进化树分析制备抗体的方法尤其适用于高水平体细胞突变的疾病的抗体的鉴定和制备。

NGS测序技术也可以应用到血清中抗体的蛋白组学分析。

B细胞的主要效应功能是分泌抗体到血液或者粘膜和呼吸道上皮细胞中，但是在这些体液里的抗体库的组成成分仍然是让人难以捉摸。Cheung、Fridy等结合高通量测序技术与高效液相色谱—串联质谱检测技术，对免疫后动物的血清中抗原特异性抗体进行分离，消化为肽片段进行液相-质谱分析，与此同时，对免疫后动物的B细胞所编码的可变区基因进行高通量测序，通过两种技术的比对，最终得到了目的VH和VL并进行配对重组表达。利用这种方法，从免疫的小鼠、兔子以及骆驼血清中快速筛选得到了针对不同抗原的高亲和力的抗原特异性抗体。利用NGS测序技术发现和鉴定在血清中的效应B细胞的VH和VL配对产生的抗原特异性抗体的方法，能够快速的获得新的诊断、治疗或者预防性抗体。为我们从康复期病人体内分离获得生物学相关的治疗性的抗体提供了新的思路。

NGS测序技术在感染性疾病研究中的应用

抗体库的高通量测序技术也可以用于由病原体刺激或者接种疫苗而产生的获得性免疫效应的机理研究。通过对患有慢性丙型肝炎的患者的免疫球蛋白高通量测序发现，与健康人相比较，患者的抗体库的V、D、J基因片段的排列以及使用长度发生了很大的改变，抗体库的多样性也降低。Parameswaran和他的工作团队发现感染急性登革热患者体内有保守的抗体标签（相同模式的CDR-H3序列），同样的，Krause等通过对抗体库的高通量测序也发现在感染了流感的不同患者体内的抗体拥有相同的保守抗原结合位点。这就提示我们可以利用高通量测序技术在感染了同种疾病的人群中找到疾病特异性的CDR3，经过验证后的这些CDR3序列就可以作为代表该病的并可以从外周血中查到的抗体标签。也就是说，可以利用NGS测序技术作为检测感染疾病的一种诊断工具。

高通量测序技术除了有诊断的作用外，还可以利用高通量测序技术分析不同年龄段的人群注射疫苗后的效果来促进针对不同人群的疫苗研发。研究发现与青年群体相比较，传染性疾病对老年人的感染率以及致死率都要高，尤其是像肺炎球菌肺炎这类肺部疾病，即使老人注射疫苗也不能得到有效的保护。与青年群体相比较，老年个体在接种流感疫苗后，IgM和IgA的CDR-H3的多样性也有降低，说明老年人体内的B细胞库数量减少，这就导致老年人的体液免疫受损。同样的，Jiang等通过分析来自不同年龄段的志愿者在接种流感疫苗前后的重链可变区库的抗体胚系基因结构、同种型和突变的程度发现与青年群体相比较，老年个体在接种疫苗后抗体库的多样性有部分的降低。所以可以通过二代测序技术对疫苗免疫前后的个体抗体库在基因水平上进行动态监测，从而评估疫苗的效果，除此之外，其还能为某些仍缺乏良好免疫效果疫苗的疾病开发新型疫苗提供新思路。

NGS测序技术在免疫失调疾病检测中的应用

自身免疫性疾病和原发性免疫缺陷症的发病机理目前还未研究清楚，目前利用高通量测序技术对免疫失调的病人的抗体库的分析的研究还很少。H.-Christian和他的团队通过对多发性硬化症患者脑脊液中的B细胞和外周血中的B细胞高通量测序发现在外周血以及中枢神经系统含有相同的效应B细胞，通过检测外周血中的B细胞增殖就可以判断在多发性硬化症或者其他炎症的中枢神经系统中B细胞的增殖情况，这一指标可以用于研究疾病发展情况和治疗效果分析。突发性IgG4相关的胆管炎，是一种与血清中IgG4的含量相关的自身免疫疾病，高通量测序发现在患者受影响的组织和外周血中有大量的IgG4克隆增殖发生，但是在皮质类固醇的治疗后，这种IgG4克隆增殖就消失了，这就表明IgG4克隆增值量的测定是辨别疾病的一个显著特征。因此，自身免疫性疾病的研究可以通过高通量测序识别潜在自体反应克隆来定量早期或已确诊的自身免疫性疾病患者的外周血抗体库，作为早期诊断用药的依据。

NGS测序技术在癌症诊断中的应用

在B细胞成熟的各个阶段会产生一系列疾病，比如说白血病，淋巴瘤和骨髓瘤等恶性肿瘤。我们可以通过高通量测序比较患者用药前后抗体组库的变化来监测疾病指导用药，预防肿瘤复发，也可以通过检测肿瘤模板克隆型，作为癌症早期诊断、预防手段。利用NGS测序技术对治疗后的慢性淋巴细胞型白血病病人的外周血里的可变区基因测序，可用于动态监测治疗后患者体内癌症细胞以及微小残留白血病，也可用于治疗后效果的评估以及疾病复发的监测。目前临床检测慢性淋巴细胞型白血病和其他的一些淋巴系统恶性肿瘤的治疗效果时，大多采用的方法是对每一位患者进行特异性PCR来验证疾病是否复发，但过程繁琐。利用高通量测序技术，只需要分析治疗前后患者的抗体库的变化，进而检测由白血病患者编码的抗体是否存在就可以判断疾病是否复发。除此之外，对慢性淋巴细胞白血病和恶性血液病患者分析发现在很多患者中都能检测到相同的CDR-H3模板。这种恶性肿瘤模板克隆型在还未真正显示临床疾病的受试者中出现的频率很低，因此，利用高通量测序技术检测患者体内恶性肿瘤模板克隆型可以作为一种有效的早期诊断工具。