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激光扫描共焦显微镜技术 原理 Confocal利用放置在光源后的照明针孔和放置在检测器前的探测针孔实现点照明和点探测，来自光源的光通过照明针孔发射出的光聚焦在样品焦平面的某个点上，该点所发射的荧光成像在探测针孔上，该点以外的任何发射光均被探测针孔阻挡。照明针孔与探测针孔对被照射点或被探测点来说是共辘的，因此被探测点即共焦点，被探测点所在的平面即共焦平面。计算机以像点的方式将被探测点显示在计算机屏幕上，为了产生一幅完整的图像，由光路中的扫描系统在样品焦平面上扫描，从而产生一幅完整的共焦图像。只要载物台沿着Z轴上下移动，将样品新的一个层面移动到焦平面上，样品的新层面又成像在显示器上，随着Z轴的不断移动，就可得到样品不同层面连续的光切图像。   共焦显微镜与传统显微镜的区别 1 、抑制图像的模糊，获得清晰的图像  2、具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片  3、增加侧向分辨率  4、由于点对点扫描去除了杂散光的影响  激光扫描共焦显微镜的设计特点： 1、点照明 2、具有照明pinhole和探测pinhole 3、照明pinhole和探测pinhole共轭（共焦）、共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面 4、具有扫描系统——逐点扫描成像 5、具有多个（四个）荧光通道，可同时探测多个被标记物 技术指标（Leica TCS SP2）: 1、 xy分辨率比传统显微镜小1.4x 传统显微镜:Rxy=0.61λ/NA （0.25μm） Confocal: Rxy=0.41λ/NA （0.18 μm） 2 、样品的最大厚度： 取决于：物镜的NA、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围（166μm、Z-wide） 3、样品的最小光切厚度:（载物台最小移动距离为40nm） 取决于：物镜的NA、针孔大小 Z轴的最小移动步距:40nm Z轴的分辨率:0.35μm 4、激光器 Ar激光器：458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe ：543nm；HeNe ：633nm Ar激光器(UV): 361nm 激光器的特点： 1）方向性好：激光基本延直线传播 2）单色性好：AX=10-8nm 3）高亮度：激光方向性好，其在空间上的能量分布是高度集中的。 4）偏振性：激光为平面偏振光，光纤耦合 5.四个荧光通道，一个透射光通道 即除了可同时釆集多标记荧光图像外还可以同时釆集透射光图像，但透射光图像为非共焦图像。 6.扫描速度： slow 2201ines/s 512x512 2-3秒 slow2 4401ines/s （2：双向扫描） medium 4501mes/s 512x512 1.7秒 medium2 9001ines/s fast 1000lines/s 512x512 0.7秒 128x128 0.2 秒 fast2 20001ines/s 7.扫描密度： 64x64 128x128 512x512 1024x1024 2048x2048 激光扫描共焦显微镜应用 功能： 1、多荧光标记样品的高清晰度、高分辨率图像采集 2、无损伤、连续光学切片,显微« 3、真正的三维重组 4、假三维图的显示 5、可沿Z轴（xy平面）和Y轴（xz平面）方向进行光切 6、定量分析 7、时间序列扫描:xyt、xyzt和xt扫描 8、图像处理 9、旋转扫描 10、感兴趣区域扫描 11、光谱扫描 应用： 1、定位、定量 2、三维重组 3、动态测量 ·活细胞或组织内游离 · 自由基的检测 · 药物进入细胞的动态过程、定位分布及定量 · 蛋白质的转位 一、定位、定量 1、免疫荧光标记（单标、双标或三标）的定位、定量：如：细胞膜受体或抗原的分布，微丝、微管的分布、两种或三种蛋白的共存与共定位、蛋白与细胞器的共定位、核转录因子转位和干细胞的增值、分化 2、细胞凋亡：AnnexinV-fitc + PI末端原位杂交-fitc + PI 3、荧光原位杂交：染色体基因定位 定位、定量研究中常用荧光探针 1、Amine-Reactive Probes 与抗体耦联、与配体耦联、与肽耦联、与人工合成的寡聚核苷酸耦联的探针，可用于免疫组化、荧光原位杂交、受体标记等
1）细胞表面抗原、胞内某种蛋白 免役荧光标记：与抗体耦联， 直标:一抗+荧光探针 间标:二抗+荧光探针 如:微管蛋白tublin （抗tublin抗体+荧光探针） 肌动蛋白actin （Palloidine+荧光探针） 2）细胞膜表面受体 配体+荧光探针 如:nAchR、mAchR、多巴胺受体（DI,D2） 标记Gml:霍乱毒素受体 霍乱毒素+FITC 2 .标记细胞器荧光探针 1）线粒体 Mitochondria Rodamin 123 505/534 , 可染活细胞，阳离子，可检测线粒体膜电位，且在多数细胞中停留时间短。 JC1,线粒体膜电位低时为单体490/527发绿光线粒体膜电位高时为多聚490/590发红光可标记活细胞线粒体，且为检测线粒体膜电位最佳探针。 Mitotracker Green FM 490/516,染活细胞或固定细胞，稳定不漏出。 Mitotracker Orange CMTMRos 551/576,（氧化型） Mitotracker Orange还原型，只能染活细胞。 2）溶酶体 Lysosome 中性红541/640：微偏碱性，可标记溶酶体等酸性器官 为非特异性 AO： LysoTracker Green DND-26 504/511,染活细胞 LysoTracker Blue LysoTracker Red 3）内质网 Endoplasmic Reticulum DiOC6 484/500：非特异性，较高浓度标记内质网，较低浓度标记线粒体 4）高尔基体 Golgi apparatus NBD C6-ceramie 466/536,可染活或死细胞 细胞器的单克隆抗体 5）细胞核  3、GFP绿色荧光蛋白 GFP的的发现：60年代，Shimomura等首先从水母中分离出一种水母发光蛋白(aequoren),该蛋白与钙和肠腔素结合后可产生蓝色荧光。然而水母整体几提取的颗粒都呈绿色，后经证实在水母体内还存在另外一种发光蛋白即绿色荧光蛋白GFP,后经研究表明，在水母体内 将外源基因与GFPDNA相连，GFP可作为外源基因的报告基因实时监测外源基因的表达。 GFP主要应用： ●对活细胞中的蛋白质进行准确定位及动态观察。 可实时原位跟踪特定蛋白在细胞生长、分裂、分化过程中或外界刺激因子的作用下的时空表达，如某种转录因子的核转位、蛋白激酶C的膜转位等。 ●GFP基因与分泌蛋白基因连接后转染细胞，可动态观察该分泌蛋白分泌到细胞外的过程。 ●GFP基因与定位于某一细胞器特殊蛋白基因相连，就能显示活细胞中细胞核、内质网、高尔基体、线粒体等细胞器的结构及病理过程。 ●可用于观察分子的运动(FRAP) ●蛋白之间的相互作用(FRET) 三.动态测量 ●Physiology:细胞内离子动态变化测量 1)、游离 ●程序化测量:用timelapse中 的编程按钮可进行不同时间序列的扫描测量。 ●浓度绝对测量 1)单波长公式法 Fluo3: 530nm
●测量时切记细胞内静息 细胞内生理 细胞内 2)标准曲线法 根据仪器条件和负载条件，以不同 3)比例荧光的测量 双波长(比例荧光: ratio) Indo1(360, 420/480), fura2(340/380, 440) 快速 1.改变扫描速度 2.釆用双向扫描 3.减少釆样点数(牺牲空间分辨率) 4.釆用线扫描(xt) 细胞器的测量 1.线粒体内游离 Fluo-3 + TMRM（线粒体荧光探针，红色） 2.特异定位的重组水母发光蛋白 水母发光蛋白与CT+结合后发蓝光； 用含有水母发光蛋白和含有特定细胞器蛋白的表达载体转染细胞，可测定亚细胞器内的游离 目前已商品化的探针可检测：线粒体、内质网、细胞核内的游离 细胞内游离 ·钙的特性 1.细胞内外的电化学梯度 2.细胞膜渗透性稍有改变或钙库释放稍有增加，导致胞内钙明显升高 3.细胞内钙为细胞激活"开关" ·细胞内钙的生理作用 1.肌肉的兴奋收缩-收缩偶联 2.神经递质的释放 3.学习记忆的增强 4.卵子受精 5.细胞分裂和再生 6.细胞调亡 7.细胞间通讯 8.细胞信号传导 9.DNA合成 10.基因表达 ·细胞内钙超载与疾病 1.高血压、脑缺血、心脏病、内分泌病一胞内钙浓度异常。 2.糖尿病、风湿性关节炎、多发性硬化病一胞内钙浓度增高。 3.人体缺钙一骨钙大量丢失，神经细胞的钙浓度增高。 4.老化和老年性痴呆-神经细胞内钙浓度增高。 细胞内生理 细胞内 电刺激引起骨骼肌细胞的 · pH值的检测: BCECF-AM 490nm 530nm 6.5-7.5 Snarf-l-AM 488nm 580/640nm 7.0-8.0 ●自由基的检测 荧光探针: 2-氢，2氯荧光素乙酰乙酸盐
DCF-H (不荧发光)→DCF (发荧光) *样品不能在镜下用汞灯照射及观察 Dihydrorhodamine 123 ( 507nm/529nm )
rod123 (发光) 膜电位的测量： 标记膜电位探针（慢反应）: JC1510nm530/590mn Dioc5 ⑶548nm573nm Dioc6(3)484mn500nm 快反应探针： D1-4-ANEPPS496mn703nm D1-4-ANEPPS498nm713nm 细胞膜静息膜电位：-70mV 线粒体膜电位：-150mV 以上均属于阳高子探针，更容易与线粒体亲和，为线粒体膜电位探针 荧光能量共振转移 能量转移：能量从分子的一个部位向另一个部位的传递,或能量从一个分子向另一个分子传递。能量的提供者叫能量供体，能量的接受者叫能量受体。 荧光能量共振转移的条件： ·两个荧光分子：供体-FL1,受体-FL2 ·供体与受体的距离在2-7nm ·供体的发射波长与受体的激发波长一致 样品要求： 1.经荧光探剂标记（单标、双标、三标） 2.固定的或活的组织 3.固定的或活的贴壁培养细胞应培养在Confocal专用小培养皿或蛊玻片上 4.悬浮细胞，甩片或滴片后，用盖玻片封片 例：长时间观察活体阿尔茨海默病模型 小鼠β-淀粉蛋白形成的状况 |
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分布和浓度的变化，测量（
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