核酸检测

检测技术

HIV基因结构

HIV基因组由两条单链RNA组成，每个RNA基因组约为9.7k，在RNA5′端有一帽结构（m7G5ppp5′GmpNp），3′端有poly（A）尾巴。HIV的主要基因结构和组合形式与其他反转录病毒相同，均由5′末端长重复（long terminal repeat，LTR）、结构蛋白编码区（gag）、蛋白酶编码区（pro）、具有多种酶活性的蛋白编码区（pol）、外膜蛋白（env）和3′末端的长重复LTR区组成。

核酸提取均采用磁珠法。

1）磁珠提取的原理：

将磁珠上标记特异性吸附核酸的物质特异性吸附核酸，并通过磁分离技术将病毒核酸从裂解液中提取出来。

2）步骤：

裂解—吸附—洗涤—洗涤—洗涤—洗脱

3）优点：

a.磁珠提取特异性高，受标本因素影响小，灵敏度高

b.易于实现自动化

4)缺点：

a.成本较高、并需要一定的仪器(半自动、全自动)。

b.完全手工工作，工作量太大。

应用套式聚合酶链反应(nPCR)检测技术

根据HIV-1 gag.pol和env基因序列设计了套式聚合酶链反应(nesled polymerasechain reaction，nPCR)引物。将外周血单个核细胞裂解液先用外侧引物扩增，其产物再经内侧引物扩增，直接走凝胶电泳判定结果。nPCR的敏感性。较常规PCR高100～1000倍，可检测到0.5fg质粒DNA和50μ1HIV-1感染者外周血样中的HIV基因。

根据专业文献记载，用本法检测63名HIV-1感染者全为阳性，而61名健康人和可疑者均为阴性，后者经追踪检测抗体排除了HIV-1感染。

由此可知，nPCR是一种敏感性极高、特异性很强、操作简便易行的HIV-1基因检测技术。它已经在早期诊断和外周血病毒含量检测中发挥了重要作用，而且有着更广阔的应用前景。

艾滋病核酸检测的优点

人体感染艾滋病病毒后，一般需要2-12周，平均42天左右血液中才可检测到HIV抗体。在这段时期内，常规检测技术根本无法检测出HIV病毒，这就是常说的“HIV窗口期”。“窗口期”的存在，也解释了为什么一些病人在接受了正规医院输血后却感染艾滋病的原因。

在感染过程中，首先出现的是病毒RNA，这时可以用PCR的方法检测出来，之后出现的是IgM抗体，使用双抗原夹心法即可以检测出来，然后出现的是IgG抗体，使用间接法可以检测出来。

现在省市疾病控制中心和检测试纸，使用的检测方法都是检测抗体抗原，无法避免“HIV窗口期”因素的干扰。所以说，常规检测技术在HIV窗口期内存在重大缺陷。

检测意义

有些人认为艾滋病既然无法治愈，查出来也没用，不愿进行核酸检测。实际上，早期诊断、早期治疗不仅有利于延缓病情发展，提高生活质量，还可及时保护他人免受感染，有利于艾滋病的控制。

1、解决艾滋病病毒感染的“窗口期”问题

原来的HIV免疫学检测方法都存在一定的窗口期。艾滋病病毒在进入人体后，机体需要经过一段时间才会产生抗体，在此期间血液抗体检测呈阴性，抗原抗体通常是在感染后3—6周后才能被检测出来，时间上较久，而且在准确度上会大打折扣。在窗口期虽测不到HIV抗体，但体内已有HIV，因此窗口期同样具有传染性。

在血液筛查方面，艾滋病病毒核酸检测无疑可以增加血液的安全性。国家相关法律规定，由窗口期血源引起的感染不属于医疗事故。原来的免疫学检测方法都存在一定的窗口期，这样给血液安全带来很大的威胁。在目前EIA试剂检测后，美国几种主要经血传播病毒的“窗口期”分别为：HIV 22天，HTLV 51天，HCV 72天，HBV 63天；输血后病毒危险性分别为1:493 000，1:641 000，1:103 000和1:63 000。在美国，艾滋病病毒核酸检测已经常规用于HIV 和HCV筛查。这样做大大降低了输血后感染HIV病毒的残余危险性。

2、及早发现，早期药物预防，降低感染几率

进行HIV病毒核酸检测，能及早发现感染，在HIV病毒入侵两周内，及时注射丙种球蛋白抑制HIV，可以降低被感染的几率。

艾滋病病毒是逆转录病毒，所谓逆转录病毒是它在侵入宿主细胞后，以自己的单链RNA为模板，按照碱基互补配对原则，在逆转录酶的作用下，合成cDNA，新合成的cDNA插入宿主的核DNA中，随宿主DNA复制、转录、翻译达到扩增目的病毒。丙种球蛋白是逆转录抑制剂，就是阻止HIV逆转录宿主DNA过程的药物。及时发现，尽早治疗，能降低被感染的几率，也能增强机体对HIV 的特异性细胞和体液免疫应答，缩短潜伏感染的半衰期，维持CD4+ 细胞的功能，减缓艾滋病的病程进展。

美国《时代》杂志网站近日发布了“2011年十大医学突破”评选结果。其中有一项即为“艾滋病防治的新进展”。新研究发现，抗逆转录病毒（ARV）药物不仅帮助艾滋病患者抗击HIV，还能让健康人远离艾滋病毒。美国华盛顿大学一项涉及4758名参试者的研究发现，服用该药的健康者HIV感染率降低73%。

3、快速排查感染隐患，解除恐艾心理压力

近年来，随着艾滋病的迅猛发展，有许许多多的人患上了这种艾滋病恐惧症。恐惧，是人类的一种本能的反应，适度的恐惧对人类的生存是有利的，但不必要的、过分的恐惧却是有害的，是一种心理异常。

艾滋病恐惧症就是这样一种心理异常，它包括以下情形：不必要地过分担心自己会得艾滋病，或者毫无根据地怀疑自己感染了艾滋病，患者同时伴有一些情绪异常和行为异常，严重影响其学习、工作、生活及社会交往。

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2014年成都市血液中心在全省率先实现血液核酸检测全覆盖，有效缩短了血液检测的“窗口期”，对防控艾滋病等经血液传播疾病具有阶段性重大意义，为市民用血安全增加了一道坚固的技术保障。2015年底，成都市血液中心紧急接受并开展对西藏血液中心，以及乐山、自贡、泸州等市州中心血站的血液核酸紧急检测委托任务，为国家卫计委核酸检测紧急工作任务的完成做出了积极贡献，得到了国家、省卫计委高度赞扬，确保了2015年底全国范围内核酸检测全覆盖工作目标的完成。

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