冠状病毒病是由冠状病毒(Coronavirus)引起的一群疾病。至2003年4月共发现18种主要冠状病毒,其中有15种引起各种动物冠状病毒病,3种为人冠状病毒病。其中动物冠状病毒病包括禽传染性支气管炎(IB)、猪传染性胃肠炎(TGE)、猪流行性腹泻(PED)、猪血凝性脑脊髓炎(PHE)、初生犊腹泻(BC)、幼驹胃肠炎(FGE)、猫传染性腹膜炎(FIP)、猫肠道冠状病毒病(FEC)、犬冠状病毒病(CC)、鼠肝炎(MH)、大鼠冠状病毒病(RC)、火鸡蓝冠病(TC)等，3种人冠状病毒病是人呼吸道冠状病毒病、人肠道冠状病毒病和新发现的SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome)。
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1 冠状病毒病的病原体
冠状病毒是ＲＮＡ病毒，因在电子显微镜下发现表面有形状似日冕的棘突犹如王冠而得名。各种动物冠状病毒在分类上属于冠状病毒科冠状病毒属，冠状病毒属(Coronavirus)是冠状病毒科(Coronaviridae)中的一个属,冠状病毒科下设2个属,即冠状病毒属和隆病毒属。冠状病毒属主要包括人呼吸道冠状病毒(HCV)、人肠道冠状病毒(HECV)、鸡传染性支气管炎病毒(IBV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(HEV)、小鼠肝炎病毒(MHV)、火鸡蓝冠病病毒(TCDV)、新生犊牛腹泻冠状病毒(NCDCV)、幼驹胃肠炎冠状病毒(FGEV)、犬冠状病毒(CCV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、大鼠冠状病毒(RCV、呼吸道和肺部炎症)、大鼠涎泪腺炎冠状病毒(SDAV)等,最近几年又发现了水貂冠状病毒(ECV)、兔冠状病毒等新成员。此外,其他动物(包括各种水生脊椎动物和陆生脊椎动物)也陆续发现由冠状病毒所致疾病,但因大部分冠状病毒的分离鉴定困难,很少有报道。隆病毒属的病原学意义迄今尚未充分阐明,目前主要包括伯尔尼病毒(Bernevirus)、布里达病毒(Bredavirus)和人类隆病毒等。
冠状病毒颗粒多为圆形、椭圆形或轻度多形性,直径为60-220ｎｍ,表面有多个稀疏的棒状突起,长约20ｎｍ。病毒颗粒内有由病毒ＲＮＡ和蛋白质组成的核心,外面有脂质双层膜。此病毒对理化因素的抵抗力不强,56℃10分钟可消除其感染性;ｐＨ3、用乙醚、氯仿或紫外线处理,均可使其灭活。
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2 冠状病毒的致病机制
2.1致病机制
病毒对机体的损伤,可导致不同程度的以至危害生命的疾病发生。症状的出现是病毒感染后造成细胞损伤的累计结果。
2.1.1致病机制的分子基础
一般认为冠状病毒的复制首先是病毒颗粒经受体介导吸附于敏感细胞膜上,一些包膜上含有HE蛋白的冠状病毒则通过HE或S蛋白结合于细胞膜上的糖蛋白受体,而不含HE蛋白的冠状病毒则以S蛋白直接结合细胞膜表面的特异糖蛋白受体。然后吸附在敏感细胞膜上的病毒颗粒通过膜融合或细胞内吞侵入,其膜融合的最适pH范围一般为中性或弱碱性。病毒感染敏感细胞后经过2～4h隐伏期,开始出现增殖,培养约10～12h就完成一步生长曲线,感染后细胞刚出现病变时,病毒增殖已达高峰。
2.1.2发病机制
在自然条件下所有冠状病毒感染都是以呼吸道或肠道作为原发复制场所,它们引起临床症状的病理生理变化主要是靶细胞(上皮细胞)发生急性杀细胞感染,因此局部免疫反应引起产生分泌抗体可以限制这些感染。许多冠状病毒呈不显性亚临床感染而在宿主群体中散布。冠状病毒引起疾病不仅决定于病毒的生物学特性,也与宿主生理状态有关。由于人冠状病毒分离及培养不易,对它的病因机制还很不清楚。
人呼吸道冠状病毒通常局限于鼻粘膜、气管的纤毛上皮及肺泡细胞中,局部免疫反应产生的S-IgA足以克服急性感染,全身体液免疫的发展可阻止病毒侵犯其他器官。病毒会引起呼吸道上皮组织的损害,但不一定出现临床症状。
人肠道冠状病毒选择性地感染肠粘膜中起吸收作用的细胞,引起绒毛的萎缩,不同毒株可选择性地侵犯小肠、大肠或结肠,表现的临床严重程度也很不一致,可从轻型一时性的肠炎至快速进展致死性腹泻;主要依靠局部免疫反应克服肠道感染。
人冠状病毒接种人胚气管器官培养时常出现纤毛运动受阻,OC43株引起的变化比229E株严重,这可能是OC43株引起的呼吸道感染常伴随有咳嗽的病因。冠状病毒引起感冒患者常主诉有头痛,这难以用非麻醉性止痛剂予以消除,人们推测病毒可能累及脑膜。
感染人冠状病毒后补体结合抗体上升是一时性的,一般维持2～3月,不超过1年,而中和抗体及血凝抑制抗体可长期存在,因此检查补体结合抗体,可作为调查当前流行的指标。获得冠状病毒感染的患者血清中可以查不出抗体,即便出现抗体,滴度也不高,这可能由于主要是局部感染,因此血流抗体量较低。人工感染冠状病毒后差不多仅有半数出现补体结合抗体,但都可查出中和抗体。中和抗体对同型病毒攻击,有一定保护作用,但对异型病毒无明显交叉保护现象。冠状病毒感染后人体抗体消长情况还不很清楚,已发现血清抗体可以降而复升,有的原滴度已较高,仍出现抗体>4倍上升,这显示存在明显的在感染,但也不能完全排除异型病原感染后引起回忆反应。
2.2病毒抗原性
由于人冠状病毒分离较难,对器官培养分出的毒株缺乏简便定型方法,而冠状病毒抗原性又较弱,不易制出高价特异性免疫血清,因此人冠状病毒有多少血清型别,至今还不清楚。目前用细胞培养分出的各株冠状病毒经中和试验证明都是同型,这可能反映细胞培养的敏感性有限,仅能支持一个型冠状病毒生长及繁殖。用器官培养分出的LP株,在抗原性上与细胞分离株密切相关,看来后者不是独自组成一个血清型;器官培养株中OC43与OC38株几乎相同,OC44株也密切相关,但后者不能适应于乳鼠脑中增殖,其他各株间虽也有不同程度单向或双向低滴度交叉反应,但相关不明显。
应用双向免疫电泳检测冠状病毒220E株及OC43株,它们都具有3种电泳速度的抗原,都是带负电荷,未发现有正电荷抗原,这两种冠状病毒的3种抗原都没有交叉反应。应用这3种抗原制作单价特异性免疫血清,都具有补体结合活性;但仅用慢速移行的抗原制作免疫血清可以具有中和及血凝抑制作用,这种抗原具有最强的免疫原性。从患坏死性肠炎新生儿粪便中分离出冠状病毒巴黎株,它在抗原性上与OC43株密切相关;应用免疫电镜及免疫印迹试验发现人呼吸道冠状病毒OC43株与人肠道冠状病毒有明显交叉反应。
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３ 冠状病毒病的流行病学
冠状病毒感染在世界上非常普遍。人群中大约10%～30%的冬季上呼吸道感染是由冠状病毒引起的,是普通感冒中居第2位的病因。冠状病毒主要发生于冬季和初春,并且在一个流行季节,通常只由单一血清型引起。冠状病毒的传播方式可分为两种:侵犯呼吸道的冠状病毒是通过呼吸道飞沫传播;侵犯肠道的冠状病毒经口传播,并且排毒时间较长。冠状病毒在人群中可引起隐形感染,人能排出病毒,这更促进潜在性传播;初步调查结果显示约45%感染者出现临床症状。呼吸道混合感染多见,冠状病毒感染中也有这种现象,可以在同份标本中与其他病毒同时分出。急性上呼吸道感染一般在4～10岁的儿童最为常见,在成年人则多为普通感冒,常在一个家庭内传播。229E和OC43病毒感染有一定的周期性,一般间隔2～3年,出现一次较大规模的流行。229E和OC43病毒有交替流行的现象。冠状病毒因为感染获得性免疫差,所以再感染较为常见。值得注意的是,在冠状病毒感染流行期,鼻病毒感染却不常见。
动物体内冠状病毒的带毒现象非常普遍,常常在无临床表现的动物呼吸道、粪便中发现有病毒粒子的存在。它们通常具有很强的宿主特异性,只感染相应的动物并引起特定的疫病;有些冠状病毒也可感染其他种类的动物,并在这些动物体内引起或不引起相应的临床症状。但由于动物冠状病毒的经济学意义,特别是感染非常规宿主时不引起明显临床表现,目前对各种冠状病毒宿主范围的了解仍然很少。已经证实,TGEV和PRCV可感染猪、猫、犬、狐狸、小鼠、豚鼠、仓鼠和兔;PEDV只感染各种日龄的猪;MHV感染小鼠、豚鼠、仓鼠和大鼠;CCV感染犬、猫、狐狸和猪;FIPV感染猫和猪;人呼吸道冠状病毒OC43株则能感染人和小鼠;其他种类的动物冠状病毒多数都只能感染相应的动物。
动物感染实验证明,冠状病毒在机体内带毒、排毒具有一定的规律性,通过呼出或咳出的气体、气溶胶、气管分泌物以及粪便排出病毒。由于感染后的潜伏期较短,一般处于潜伏期的动物排毒量少或几乎不排毒,此时进行病毒检测常常为阴性;当动物开始出现临床症状时,其体内以及分泌物、排泄物中的病毒含量达到高峰,患病动物排出的病毒毒力最强、数量最多,这个时期是病毒检测的最佳时间;临床症状消失后动物体内带毒情况与被感染动物及其冠状病毒的种类密切相关。例如,TGEV感染猪病愈后带毒至少104天;IBV感染后可从病愈20周的鸡粪便中检测到病毒,而1日龄接种IBV的鸡群几周病毒转阴后可重新排毒,至19周龄时测定仍然可从气管和泄殖腔中分离到病毒。以上情况表明,动物感染冠状病毒康复后可长期带毒,并间歇性排毒。综合冠状病毒的传播途径可知,动物主要通过呼吸道感染,也可通过口腔、眼结膜感染。病毒通过呼出或咳出的气体、气溶胶、气管分泌物以及粪便排出,可悬浮于空气中或污染工具、栏舍、厂房、饲料、饮水,这些在外界环境中随季节、气温和其他条件不同,存活时间有很大差异。如大部分IBV毒株在56℃15分钟、45℃90分钟可失去感染力,-30℃可以保持多年活性;室温下春季能存活12天,冬季能存活56天;而对TGEV的研究表明,病毒在冷冻状态下非常稳定,但在室温或室温以上温度则不稳定:来自患病猪肠组织中的病毒-20℃存放6-18个月未见滴度下降;相反,来自患猪肠组织中病毒,在21℃时干燥、腐败状况下很不稳定,3天后接种猪4头,只有两头发病;10天后接种则未能检测到病毒。细胞培养病毒分别存放于-20℃、-40℃、-80℃,365天后滴度无明显下降,而存放于37℃4天,感染性全部消失。病毒若以液体状态保存,其感染性在5℃可保持8周以上、20℃2周、35℃则仅24小时;而在直射阳光下则存活时间更短,因为该病毒对光很敏感。
冠状病毒病流行具有明显的特点,如鸡传染性支气管炎属于高度接触性传染病,主要感染2月龄内雏鸡,在鸡群中传播速度很快(2周内可波及全场),潜伏期短(平均3天),但该病的发病率和死亡率与毒株的毒力和环境因素(如气温、通风、饲养密度、健康状况、日粮配合、应激等)有很大关系。猪传染性胃肠炎的流行有明显季节性,从每年11月份至次年4月份发病最多,夏季很少发病;新疫区通常呈流行性发生,几乎所有年龄的猪都发病,10日龄以内的猪死亡率很高,但断乳猪、育肥猪和成年猪发病后多取良性经过,几周后流行即可终止;青年猪、成年猪能够产生主动免疫,但康复猪中50%带毒,排毒时间可达2～8周,长者可达104天之久;在老疫区,由于病毒和病猪持续存在,大多数母猪具有特异性抗体,所以哺乳仔猪10日龄以后的发病率和死亡率很低。犬冠状病毒的传染来源主要是病犬和带毒犬,病犬排毒时间为14天,保持接触性传染的能力为期更长;病毒在粪便中可存活6-9天,在水中也可保持数日的传染性。
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4 冠状病毒病的主要临床表现
动物冠状病毒具有胃肠道、呼吸道和神经系统的嗜性,特别是鼠肝炎病毒JHM毒株可以引起小鼠的脱髓鞘性脑脊髓炎。潜伏期短,如鸡传染性支气管炎的潜伏期为18小时至3日,能在2-3天内迅速传播蔓延至全群;猪传染性胃肠炎潜伏期为18-72小时,感染后很快传遍整个猪群,大部分猪2-3天内发病;犬冠状病毒感染的自然病例潜伏期1-3天,人工感染24-48小时,传播迅速,数日内即可蔓延全群。
传染性支气管炎的病型复杂,通常分为呼吸型、肾型、肠型等多种,其中还有一些变异的中间型。该病毒血清型多,变异快,常常容易引起免疫失败,并导致鸡的增重和饲料报酬降低。呼吸型幼龄鸡感染传染性支气管炎主要引起呼吸器官功能障碍,表现为突然甩头、咳嗽、喷嚏、流泪、喘息、气管罗音、鼻分泌物增多,偶尔出现脸部轻度水肿。肾型主要发生于2-周龄雏鸡,发病初期可能有短期的呼吸道症状,但随即消失,临床表现主要为病雏羽毛松乱、减食、渴欲增加,排白色稀粪,严重脱水。
猪传染性胃肠炎在临床上表现为胃肠型和呼吸道型,不同年龄猪都可迅速感染发病。胃肠型表现为仔猪短暂呕吐,很快出现水样腹泻,粪便呈黄色、绿色或白色,常含有未消化的凝乳块,粪便恶臭;体重快速下降,严重脱水;2周龄以内仔猪发病率、死亡率极高;超过3周龄哺乳仔猪多数可以存活,但生长发育不良。呼吸道型通常呈亚临床型,往往需要通过组织学检查才能发现间质性肺炎变化;有时可见轻度或中度的呼吸道症状、增重明显减慢,但某些毒株感染则可引起严重的肺炎,死亡率高达60%。当PRCV与其他呼吸道病原体共同感染时,能造成保育猪、育成猪或育肥猪严重的呼吸道症状,致使猪群死淘率明显增加。
病犬发病后嗜眠、衰弱、厌食,最初可见持续数天的呕吐,随后开始腹泻,粪便呈粥样或水样,黄绿色或桔红色,恶臭,混有数量不等的粘液,偶尔可在粪便中看到少量血液,临床上很难与犬细小病毒区别,只是CCV感染时间更长,且具有间歇性,可反复发作。
小鼠传染性肝炎病毒在新生乳鼠、断乳小鼠、成年小鼠急性和慢性感染时,其临床表现随病毒株及其组织亲嗜性,小鼠品系、年龄,小鼠所处环境等有差异。急性病例,小鼠表现精神抑郁、被毛粗乱、营养不良,脱水和体重减轻等症状。自然条件下,小鼠感染低毒力的MHV多呈隐性感染。但裸鼠感染低毒力的MHV则可表现亚急性或慢性肝炎。新生乳鼠感染表现急性腹泻、脱水、被毛粗乱、厌食、体重减轻,生长迟缓等症状,甚至死亡。
冠状病毒引起的人类疾病有两类，首先是呼吸道感染，其次是肠道感染。冠状病毒是成人普通感冒的主要病原之一，在儿童可以引起上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道。冠状病毒感染的潜伏期一般为２－５天，平均为３天。典型的冠状病毒感染呈现流涕、不适等感冒症状。不同型别病毒的致病力不同，引起的临床表现也不尽相同，ＯＣ４３株引起的症状一般比２２９Ｅ要重。有报道冠状病毒感染可以出现发热、寒战、呕吐等症状。病程一般在一周左右，临床过程轻微，没有后遗症。冠状病毒可以引起婴儿、新生儿急性肠胃炎，主要症状是水样大便、发热、呕吐，每日１０余次，严重者可以出现血水样便。
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5 冠状病毒病的诊断
5.1病原学诊断
(1)病毒的分离和培养 一般用鼻分泌物,咽漱液混合标本分离病毒阳性率较高,用人胚器官培养或细胞培养后分离病毒,电镜检查病毒颗粒。中和试验、补体结合试验和血凝抑制试验等测定患者急性期和恢复期血清中的抗体滴度。由于病毒抗原的免疫原性较弱,约有50%的人感染后可能检测不出抗体。
(2)间接ELISA法 采用双倍细胞接种229E,上清液为抗原,包被苯乙烯板,血清从1∶50起作连续二倍稀释,反应完毕后在405nm波长测定各孔OD值,以S2/S1≥2为抗体阳性判定。该法敏感、简便、迅速。
(3)放射免疫放射法 该法与间接ELISA法同样为诊断冠状病毒感染的较优的方法。
(4)免疫荧光法 该法是目前常用的病毒快速诊断方法,细胞培养感染冠状病毒,在胞浆出现免疫荧光,在核周最强,并随着培养时间的延长,荧光细胞增多,呈局灶状,可以计数进行病毒定量,比镜检细胞病变及蚀斑试验敏感。
5.2诊断和鉴别诊断
感冒是极为常见的传染病,主要的临床症状是发热、鼻炎及咽炎,在不同年龄均可引起呼吸困难。这是各种急性传染病开始时的常见表现,因此在初发病时临床上较难作出鉴别诊断,但当疾病发展后,其他症状出现,就可进行鉴别。引起感冒的病毒种类甚多,最主要的是鼻病毒,其次就是冠状病毒,此外还有流感病毒、副流感病毒、腺病毒及呼吸道合胞病毒等,这些主要靠病原学检查予以鉴别,但在临床表现上也有一定差别(表1)。
表1 不同病毒引起感冒的临床表现差别
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6 冠状病毒病的控制策略
6.1治疗方法
目前,临床上治疗动物冠状病毒感染的药物尚未研制成功。已报道抗病毒金刚胺和Isathiazone化合物能够抑制TGEV在细胞培养中的增殖;人冠状病毒229E株和TGEV的受体抑制剂为Ubenimex(商品名为百士欣或乌苯美司),但这些药物均未见临床应用的报道。虽然在TGEV感染的早期,猪肠道中可检测到高水平的α干扰素,但该种干扰素在疾病恢复或致病机理中的作用尚无定论。研究表明,干扰素可能激活新生仔猪体内的自然杀伤性细胞,它对TGEV感染起着某种程度的抑制作用。另外,在TGE暴发期间,用1-20IU/人α干扰素给1-12日龄给仔猪口服,连续4天,其存活率明显高于未给药猪,但给新生仔猪口服α干扰素,其存活率却未见增加。
6.2免疫预防
TGE康复猪可抵抗强毒攻毒主要是因肠道粘膜局部免疫的结果,感染年龄及免疫状况会影响主动免疫的持续期。肠道局部免疫机制的建立需要通过口腔和鼻腔途径接种疫苗,这样可在猪肠液和血清中检出特异性sIgA,而肠道外途径接种疫苗不能检出这类抗体。近年来证实,TGEV强毒株能够刺激肠道淋巴样组织产生大量的IgA抗体分泌细胞,而活TGEV弱毒株或PRCV弱毒株则只能诱导极少量的IgA抗体分泌细胞。
除局部抗体介导免疫外,细胞介导免疫应答在抗动物冠状病毒感染中也起重要的作用。研究发现,CD4T辅助细胞参与冠状病毒感染的淋巴细胞增殖反应,尽管这些病毒的三种主要结构蛋白都存在T细胞抗原位点,但N蛋白的T细胞抗原位点所起的作用最大;同时发现机体内高滴度中和抗体的产生,至少需要两种TGEV结构蛋白(S、N蛋白或S、M蛋白)的刺激。这个发现对TGEV亚单位疫苗及抗TGEV重组疫苗的设计具有重大意义。
为了控制各种动物冠状病毒感染,目前广泛应用相应的弱毒苗和灭活苗,前者的接种途径主要是口服,禽类可滴鼻、点眼;后者则进行皮下、肌肉或腹腔内注射。但使用弱毒苗时,免疫效果受母源抗体的影响较大,同时存在疫苗毒力返强或与强毒发生基因重组的危险;灭活苗的免疫效果相对较差,主要因为细胞免疫力较弱、局部免疫机制不能建立的缘故。各种形式的基因工程疫苗或亚单位疫苗研制也正在进行。Gough等报道给10头断奶仔猪肌肉接种TGEV亚单位佐剂苗,可以抵抗强毒攻击的报道。但研究人员还报道经非肠道途径给哺乳仔猪接种杆状病毒表达的S蛋白佐剂苗(有4个主要抗原位点),能够诱导TGEV中和抗体的产生而不能抵抗TGEV的攻击。近年来,针对各种动物冠状病毒的防治,含有保护性抗原的转基因植物、DNA疫苗、活病毒载体疫苗、细菌载体疫苗等,已经进行了大量的研究,相信未来一段时间内会有好的产品走向市场。
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