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组织工程是一种修复大面积骨缺损的策略。其中支架材料和生长因子是影响骨再生效果的两个关键因素。近日中国科学院长春应用化学研究所的丁建勋教授课题组和陈学思教授课题组合作制成了一种促进骨修复的电活性复合支架。研究者将人骨形态发生蛋白-4(phBMP-4)的基因片段拼接到非病毒人工重组质粒载体(PSTAR)中形成pSTAR-hBMP-4质粒(phBMP-4)，phBMP-4在强力霉素(Dox)存在的条件下严格控制表达，然后将其负载在聚L-乳酸-苯胺五聚体-聚(L-乳酸)三嵌段共聚物(PLA-AP)与聚乳酸-羟基乙酸/羟基磷灰石(PLGA/HA)相结合的电活性组织工程支架中以实现phBMP-4的控释。这种PLGA/HA/PLA-AP/phBMP-4复合支架在电刺激下可有效控制基因释放和基因表达，从而在兔桡骨缺损模型中表现出促细胞增殖，增强成骨分化，促进骨愈合的作用(Scheme 1)。 
Scheme 1. Construction of a smart electroactive tissue engineering scaffold with ability to control release and expression of hBMP-4 for efficient bone repair. 研究者首先研究了Dox剂量与受控基因表达之间的关系(Fig. 1A)。结果表明，在低浓度时，兔成骨细胞中phBMP-4的表达与Dox呈剂量依赖性，但当浓度高于10.0 μg mL−1时，phBMP-4的表达不存在剂量依赖性。ELISA进一步检测细胞上清液中phBMP-4蛋白含量，如Fig. 1B所示，当Dox浓度为10.0 μg mL−1时，蛋白质含量最高，低于10 μg mL−1时各组之间存在显著差异。因此，10.0 μg mL−1的Dox被认为是体外提高phBMP-4表达的最佳剂量。phBMP-4被Dox激活后会持久释放，但可通过添加和去除Dox来改变。此外成骨相关基因COL-I表达趋势与BMP-4相似，表明Col I可能受BMP-4的影响；ALP和RUNXII的基因表达与BMP-4的表达不完全相同，但仍与BMP-4的表达呈正相关(Fig. 1C-F)。 
Fig. 1. Validation of controlled gene expression. 随后研究者进行了材料的合成与表征(Fig. 2）。AP是基于琥珀酸酐、对苯二胺、硫酸铵和N-苯基-1，4-苯二胺的氧化偶联反应合成的。然后，以二环己基碳二亚胺为缩合剂，二甲基氨基吡啶为催化剂进行缩合反应，得到PLA-AP三嵌段共聚物。当PLA-AP共聚物溶解在DMAP中时，AP嵌段在APS的影响下从还原态聚苯胺(LM)逐渐氧化到中间态聚苯胺(EM)状态，最终达到氧化态聚苯胺(PN)状态，PLA-AP共聚物的颜色也根据氧化状态而变化，从AP嵌段处于LM状态时的亮灰色到EM状态下的蓝色。这种两步氧化过程可以通过PLA-AP的伏安图进一步验证。所有类型的支架都具有相似的孔隙形态和高的孔隙率。PLGA/HA和PLGA/HA/phBMP-4支架的平均孔径分别为50±2.5和100±5.0 μm，明显小于PLGA/HA/PLA-AP和PLGA/HA/PLA-AP支架的平均孔径(130±10.0 μm)和PLGA/HA/PLA-AP(180±25.0 μm)。此外，PLGA/HA、PLGA/HA/PLA-AP、PLGA/HA/phBMP-4和PLGA/HA/PLA-AP/phBMP-4支架的孔隙率分别达到86.2%、89.7%、86.9%和88.0%，为细胞扩张提供了足够的空间。PLGA/HA，PLGA/HA/PLA-AP，PLGA/HA/phBMP-4和PLGA/HA/PLA-AP/phBMP-4支架的压缩强度分别为1.72，1.73，1.58和1.68 MPa，这说明在体系中加入PLA-AP的导电聚合物或phBMP-4的基因载体复合物对这些支架的力学性能没有显著影响。
Fig. 2. Synthesis, structure, and physical characterizations of PLA-AP and porous composite scaffolds. 研究者随后研究了电刺激条件下phBMP-4表达调控对细胞增殖和分化的影响，Fig. 3A显示电刺激并不影响PLGA/HA/phBMP-4和PLGA/HA/PLAAP/phBMP-4支架中phBMP-4的持续释放。电刺激促进了细胞增殖率，也增强了ALP表达，进而使得骨矿化水平显著提高（Fig. 3）。总体而言，含有基因构建物的支架具有优异的成骨性能，而含有电活性材料的无基因支架仅在电信号的刺激下才显示出成骨诱导作用。
Fig. 3. Influence of electronic signal on gene release, cell proliferation, and differentiation. 研究者对Dox在体内对phBMP-4表达的调节作用进行了研究。如Fig. 4A所示，在没有Dox诱导的对照组以及PLGA/HA和PLGA/HA/PLA-AP实验组中hBMP-4表达缺失。相反，在含有Dox和pSTAR-hBMP-4/Au-PEI基因载体复合物(PLGA/HA/phBMP-4和PLGA/HA/PLA-AP/phBMP-4)支架组中，hBMP-4的表达显著增强。如Fig. 4B所示，在兔双侧桡骨中段造成2.0 cm全层骨缺损，对照组术后两周出现轻微矿化。相比之下，PLGA/HA/PLA-AP和PLGA/HA/phBMP-4组在第4周出现了相对较强的矿化，尤其是PLGA/HA/PLA-AP/phBMP-4组，表现出明显的矿化连续性。H&E和Masson三色染色结果(Fig. 4D and E)显示：与对照组相比，各支架组在术后12周均能观察到新骨形成，但新生骨周围的支架未见明显降解。所有电刺激组均有更多的新骨形成，表现出更好的骨再生能力，更高的骨量和更成熟的骨组织。 
Fig. 4. In vivo repair of smart electroactive polymer scaffolds. 该研究合成了一种独特的PLGA/HA/PLA-AP/phBMP-4支架，将phBMP-4有效地整合到该支架材料中，在Dox存在下予以电刺激控制基因释放/表达，促进细胞增殖，增强体内外成骨分化，提高骨修复的效率，为临床应用提供了坚实的理论基础。 本研究由中国科学院长春应用化学研究所的丁建勋教授课题组和陈学思教授课题组共同完成，并于2019年11月14日在线发表于Biomaterials。 Liguo Cui, Jin Zhang, Jun Zou, Xianrui Yang, Hui Guo, Huayu Tian, Peibiao Zhang, Yu Wang, Ning Zhang, Xiuli Zhuang, Zhongming Li, Jianxun Ding*, Xuesi Chen**. Electroactive composite scaffold with locally expressed osteoinductive factor for synergistic bone repair upon electrical stimulation.Biomaterials 2020, 230：119617.
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