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钛和钛衍生的生物材料具有良好的生物物理特性，可用于制作骨修复材料。钛植入物的特定表面结构可影响细胞增殖、迁移和分化。在成骨过程中，钛表面形态可调节细胞下游基因的表达，但具体的机制并不十分明确。因此来自重庆医科大学宋锦璘教授团队研究了钛板表面的纳米形貌与Wnt/β-catenin信号通路、YAP蛋白以及成骨分化的关系（Figure 1）。 
Figure. 1. Graphical abstract. 首先研究者们采用喷砂、酸蚀工艺制备了具有不同结构的钛板表面，通过扫描电镜（SEM）以及原子力显微镜观察了钛板表面的结构，并对其表面粗糙程度进行了分析，发现光滑、微米和纳米形貌表面的粗糙度参数分别为102.47、1177.75和266.54 nm （Figure 2）。 
Figure. 2. Characterization of titanium plate surfaces. Titanium plate surfaces were fabricated by sandblasting and acid etching. 接着研究者们研究了不同表面形态的钛板对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响。结果发现，不同的钛表面上细胞的增殖并无差异，表明钛表面具有较好的生物相容性。在体内成骨分化研究中，研究者将钛板植入大鼠股骨远端，14天后收集样本进行检测。H&E染色结果表明，与光滑钛表面相比，具有微米和纳米形貌的钛表面上，新骨表面单位数量和骨-植入物结合率都明显增多。在体外成骨分化研究中，结果表明微米结构和平滑结构之间成骨基因表达差异不大，但纳米表面的成骨基因表达明显增加，证明纳米表面钛板具有良好的成骨特性（Figure 3）。 
Figure. 3. Osteogenic differentiation. 接着，研究者们在体外实验中，使用Wetern-Blot检测β-catenin的表达及活性。通过荧光素酶报告基因的方法检测发现，在纳米表面上，β-catenin下游的报告基因的表达明显上调，但微米表面细胞的报告基因却表达下调 (Figure 4A)。β-catenin总蛋白受到细胞接种密度的影响，在高密度细胞培养条件下，相对于光滑表面，纳米表面上细胞的β-catenin表达上调。在低密度细胞培养下，各组细胞间β-catenin表达表达差异不大 (Figure 4B)。研究者进一步检测高密度细胞培养条件下，β-catenin在细胞核和细胞质的分布，发现不论在细胞核还是在细胞质中，β-catenin的量都按纳米>微观>平滑表面的顺序逐渐升高 (Figure 4C)。免疫荧光染色还显示，相比于其他表面，纳米表面上细胞核中β-catenin积累最高。光滑表面在MC3T3-E1细胞中仅在细胞核表达较高的YAP，而在微米和纳米表面中，细胞质和细胞核中都有较多的YAP表达。因此YAP可能与β-catenin具有一定的关联（Figure 4D）。
Figure. 4. β-catenin amount and subcellular localization.
研究者们用Western-Blot检测不同表面上YAP的表达，发现在高密度细胞培养条件下，纳米表面上细胞的总YAP量、YAP在胞质和核的分布量都低于其他两组。但在低密度细胞培养条件下，各组细胞YAP的表达无明显统计学差异。表明在高密度细胞培养时，纳米表面促进了YAP的降解（Figure 5）。 
Figure. 5. Amount and subcellular localization of YAP. MC3T3-E1 cells were cultured at high density (2×104 cells/mL) or low density (1×104cells/mL) on titanium plates with smooth, micro-, or nanotopographies for 24 hours and YAP examined by western blot. PARP was the loading control of the nuclear fraction, and GAPDH was the loading control of the cytoplasmic fraction. Results shown as mean ± SD for n = 3. (*P < 0.05, **P < 0.01). (A-B) Cells at high density. (C-D) Cells at low density. (A, C) Total YAP amount. (B, D) Cytoplasmic and nuclear YAP.接着研究者们对促进YAP降解的基质的原因进行了探索，研究者们猜测细胞自噬是YAP降解的原因，通过Western-Blot检测不同表面上细胞的自噬标记物的表达，结果显示不论在第1天还是第4天，纳米表面上细胞的LC3 II/I比值都有所上升，p62的蛋白表达下降，即纳米表面可引起细胞的自噬流。研究者将RFP-GFP-LC3腺病毒表达载体转入细胞中，利用雷帕霉素诱导自噬，通过激光共聚焦显微镜观察发现，在纳米表面上细胞的自噬现象更为明显。透射电镜结果同样表明，与光滑和微米表面相比，纳米表面上的细胞其胞质中存在更为密集的自噬体，表明纳米表面细胞的自噬程度确实比其他表面要高（Figure 6）。
Figure. 6. Autophagy on different topographic surfaces. MC3T3-E1 cells (2×104cells/mL) were cultured on different surfaces. (A-B) Autophagy markers LC3 and p62 were resolved via western blot after cells grew for (A) 1 days and (B) 4 days. GAPDH was the loading control, LC3 II/LC3 I ratio pointed LC3 conversion ratio from I to II. Results are shown as mean ± SD for n = 3. (*P < 0.05, **P < 0.01). (C) MC3T3-E1 cells were transfected with GFP-RFP-LC3 adenovirus for 48 hours, fixed with 4% paraformaldehyde; DAPI labeled the nuclei. (C) LSCM images of cells with or without treatment of rapamycin (200 nM) for 12 hours (scale bar = 16 μm). The merge number of RFP and GFP dot formation (yellow) indicated theautophagy level. (D) TEM images of MC3T3-E1 cells grown on different surfaces for 24 hours. Top row: Low magnification (scale bar = 2 μm). Bottom row: high magnification (scale bar = 1 μm). Typical autophagosomes are indicated by arrows.
然而仅仅发现纳米表面细胞自噬增高并不能说明其与YAP降解的关系，因此研究者们用自噬抑制剂氯喹处理细胞，发现在高密度细胞培养条件下，随着氯喹的加入，细胞中YAP与β-catenin的表达升高。但在低细胞密度情况下，细胞中YAP与β-catenin的表达量并不受影响。用自噬激动剂雷帕霉素处理细胞，不论在光滑表面还是纳米表面，细胞中的YAP表达均降低。免疫荧光也显示未处理组细胞中YAP主要定位于细胞核中，β-catenin则同时存在于细胞质和细胞核中。但用氯喹孵育 12 小时后，高密度细胞条件下，细胞质中YAP与β-catenin呈现更多的共定位。但在低细胞密度下，这一现象并不明显。Western-Blot则再次证明氯喹处理高密度培养细胞后，细胞质与细胞核中的YAP表达均明显升高，即表明纳米表面引起的YAP表达的降低，是由于细胞自噬作用的加强而产生的（Figure 7）。 
Figure. 7. Autophagy-regulated YAP on the nanotopographic surface.
综上所述，钛板表面纳米结构激活了MC3T3-E1细胞中的β-catenin 途径并促进了成骨分化。在细胞高密度培养条件下，钛板纳米表面的细胞自噬作用增强，促进细胞质YAP降解，从而调节β-catenin的表达量和核定位并进一步调节成骨诱导效应。 本研究由重庆医科大学张和和宋锦璘教授完成，并于2019年7月被Acta Biomaterialia接收。 论文信息：Lingjie Li, Sheng Yang, Ling Xu, Yuzhou Li, Yiru Fu, He Zhang*, Jinlin Song*. Nanotopography on titanium promotes osteogenesis via autophagy mediated signaling between YAP and β-catenin. Doi: https:///10.1016/j.actbio.2019.07.007. 供稿：于启帆 审校：过倩萍
编辑：王佳媛
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