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天然反义转录物（natural antisense transcripts, NATs）是在自然情况下生物体内产生的内源性RNA，它们与对应的互补RNA通过碱基配对，形成自然正义—反义转录物配对的双链RNA，对器官形成、细胞分化和疾病发生等各种生理和病理过程都有重要的调控作用。研究发现，NATs不是某一特定种类，而是具有一些共同特征、分属不同种类的RNA。 NATs在哺乳动物基因组内广泛存在，并且大部分转录单位（TUs）都包含NATs。与此同时，研究还发现NATs具有多个活性启动子，这就证明了NATs在哺乳动物基因组内广泛存在的原因。如FANTOM3数据库报道，小鼠转录组中70%的转录单位含有NATs，并且这些转录物绝大部分是非蛋白编码RNA。 目前研究证明，不论是正义还是反义RNA均可编码蛋白或形成非蛋白编码RNA；但在哺乳动物体内，NATs主要以反义非蛋白编码RNA（Antisense LncRNA）形式存在。Antisense LncRNA的存在给我们以提示： Antisense LncRNA可能会调节蛋白编码的正义RNA。Antisense LncRNA通常在转录水平和转录后水平对基因进行调控。 本文就Antisense LncRNA的调控作用作如下综述。 反义RNA的特点 Antisense LncRNA在基因组中分布极不均匀。Antisense LncRNA常常位于蛋白编码基因两端，如Antisense LncRNA在转录起始位点上游250个核苷酸和基因有义链下游富集。由于Antisense LncRNA很少经历剪接事件，从而导致与正义转录物相比富集程度低。在不同组织和细胞系中，正义和反义转录本的表达水平可以呈正相关也可以呈负相关。此外，研究还发现，人细胞系Antisense LncRNA的表达水平往往与正义基因的表达有关；同时，将内源的Antisense LncRNA进行基因敲除后会出现相应正义转录物出现或升或降的变化；这就表明Antisense LncRNA会在转录水平对正义转录物进行调节。 Antisense LncRNA的特性预示它们在调控基因表达时存在一系列的调控机制。关于反义转录RNA调控正义mRNA有许多假设机制。在此，我们将其归为四类进行讨论：转录水平的调节、RNA-DNA相互作用、RNA-RNA核内相互作用以及RNA-RNA胞质相互作用。 转录水平的调节 Antisense LncRNA行使这种调控机制，是因为其转录方向与正义RNA转录方向相反，而不是Antisense LncRNA本身的调节功能引起的。Antisense LncRNA在转录过程中可能会引起正义RNA的改变；下面就转录碰撞和基因重组两种模型予以分析（图1）。 转录碰撞 在同时转录正义RNA和Antisense LncRNA的过程中，两个RNA聚合酶分别于正-反义基因的启动子区域结合，开始合成RNA，并向各自的3’段移动，这样两个RNA聚合酶在两者之间的重叠区域相遇时，即开始转录碰撞，从而抑制它们的转录过程（图1a）。运用原子力显微技术，这种假设的模型已在Escherichia coli，Saccharomyces cerevisiae中得到证实。在人和小鼠的基因组转录时，转录碰撞可能是Antisense LncRNA调控正义转录物的普遍机制；但是总的来说，有确凿数据支持的转录碰撞的实例非常少。而且，Antisense LncRNA 与其正义基因的转录可能在时间上( 不同生长或发育阶段) 或空间上( 不同染色体) 根本就不可能相遇。这种模型证明了反义RNA是由于与正义RNA转录方向不同而影响正义RNA的合成。但如上所述，正义和反义RNA经常在不同时间、不同染色体上进行转录，所以这种调控模型并不是Antisense LncRNA调控基因表达的主要形式。
图1.转录水平调节模式图 基因重组 为了适应和应答外界环境的各种刺激，B和T淋巴细胞成熟过程中，在免疫球蛋白和T细胞受体基因的可变区经常发生体细胞超突变(SHM ) 或类型转换重组(CSR) ，以提高抗体对抗原的亲和力，从而产生不同的生理效应；这个过程是转录依赖性的。免疫球蛋白可变区基因的反义转录能够使局部的模板DNA 解链变为单链DNA，释放出空间便于激活诱导胞嘧啶核苷脱氨酶（AID) 靠近单链DNA，使胞嘧啶脱氨变为脱氧尿嘧啶( dU )（图1b）。这一步碱基修饰对体细胞超突变是非常重要的。而目前研究表明在可变区的反义转录使得AID可以靠近单链DNA 。在此模型中，反义转录打开DNA双链形成单链形式，起始AID酶进行的调控，在此过程中会改变染色质结构从而使DNA序列易于重组。在这两中模型中，起作用的是反义转录过程本身，而不是由其产生的Antisense LncRNA的调控作用。 RNA-DNA的相互作用 Antisense LncRNA也可能会通过表观遗传调控发挥功能，这种调控基于直接或间接的RNA-DNA或RNA-染色质相互作用。Antisense LncRNA可能会结合到相应的DNA链上产生DNA甲基化（图2a）或者通过招募组蛋白修饰酶（HME）改变染色质的状态（图2b）。与Dicer酶作用机制不同，Antisense LncRNA会在局部聚集，从而对DNA或染色质进行修饰；这些修饰继而影响到上述修饰区域的相邻区域，这种第二次修饰可能仅仅限于一个基因的启动子或增强子，但不断地发展下去最终会影响到整条染色体，如女性中X染色体的失活。
图2.天然Antisense LncRNA引起染色质和DNA表观遗传的变化 修饰DNA或染色质 Antisense LncRNA可能会引起DNA甲基化、DNA去甲基化和常染色体基因座非印记修饰等。编码正义RNA的DNA启动子区域发生DNA或染色质修饰往往会抑制转录；例如一种Antisense LncRNA会引起α-血清球蛋白基因（HBA2）甲基化，从而导致HBA2基因沉默。 Antisense LncRNA也会通过DNA甲基化或形成异染色质，从而影响到编码p15，p21和孕酮受体（PR）的基因产生转录水平的沉默。有义链启动子区域组蛋白H3的第27个氨基酸上三甲基化（H3K27me3）往往抑制正义转录。如CDKN1A(一种抑癌基因)的Antisense LncRNA通过招募调节复合物诱导H3K27me3，从而抑制有义启动子活性。由于一个细胞特定基因只有两个DNA拷贝，因此，每个细胞内两个Antisense LncRNA足以结合到相应DNA链行使调控功能。 启动子活性与染色质重塑 重叠转录区小RNA（＜50nt）、启动子相关小RNA（PASRs）、终止子相关小RNA（TASRs）、启动子上游转录物（PRPMPTs）以及转录起始位点相关RNA（TSSa-RNAs）已在人类基因组中报道。相对于蛋白编码基因往3’端转录，TSSa-RNAs会在活性启动子两侧均有转录。这种异常启动子活性已有充分文献证实，并且在50%以上小鼠和人类基因组均有发现。启动子的这种活性是对传统基因认识的一种挑战，异常的启动子活性暗示了基因不再有明确的5’和 3’端界限的存在。 PROMPTs和TSSa-RNAs的转录区域与RNA聚合酶Ⅱ以及活性染色质重叠，研究表明这种局部RNA的聚集会维持染色质状态，从而有利于启动子的活性。转录起始和终止位点短链RNA以及上游基因的转录往往与活性染色质共定位，预示着这些RNA转录物不仅会调控正义转录物，还会参与染色体的重塑。 基因组印记 在大多数情况下，亲本源的基因均等表达；但在印记基因中，仅特异地表达父源或母源的等位基因。研究发现，Antisense LncRNA往往与基因印记有关，两者之间的相关度在81%以上。如父源表达的胰岛素样生长因子受体2反义RNA（Airn） 通过重叠Igf2r 启动子区域抑制RNA 聚合酶Ⅱ的募集，最终抑制胰岛素样生长因子2型受体（Igf2r）的表达。目前已在人类和小鼠中发现160余种印记基因。 X染色体失活 X 染色体失活过程是指雌性哺乳动物中的两条X 染色体中的一条随机失活，以达到雄性和雌性中表达等量的X 关联基因。来自X 染色体失活中心的两个长链非蛋白编码基因，即X 染色体特异性失活转录物(Xist) 和Xist 的Antisense LncRNA(Tsix) 共同控制着X 染色体的失活。Xist 的表达只来源于失活的X 染色体，通过结合PRC2 复合物，以催化形成H3K27me3，并使PRC2 复合物作用于X 染色体，改变染色质状态，从而抑制基因的转录。Tsix通过对Xist启动子区域的染色质结构进行修饰，抑制Xist 的活性，与后者共同调控X 染色体失活过程。 RNA-RNA核内相互作用 这种机制基于核内反义和正义RNA会形成二聚体（图3Aa）。RNA二聚体的形成会对正义mRNA的表达产生重要影响。核内RNA二聚体的形成会封闭剪接位点，影响mRNA 前体的剪接过程，产生不同的mRNA 成熟体。 选择性剪接 Antisense LncRNA与正义RNA结合形成二聚体会封闭剪接位点，从而改变不同剪接体之间的平衡（图3Ab）。例如甲状腺激素受体有TRα1 和TRα2 两种可变剪接体，二者在细胞内的表达水平保持一定比例，功能上是拮抗的。TRα2 的反义链表达Antisense LncRNA RevErbAα，对TRα2 5’剪接位点的活性有影响，可导致TRα2 的mRNA 水平下调，改变与TRα1 的比例，调节甲状腺激素受体在不同组织或生理条件下的功能状。此外，Antisense LncRNA还会通过类似途径引起聚腺苷酸化影响基因的转录。 mRNA的运输与Antisense LncRNA核滞留 反义和正义RNA二聚体的形成会影响到mRNA的核运输；此外，核内蛋白质或其他RNAs的相互作用会引起Antisense LncRNA在核内滞留，然而目前尚不明确其中的机制。Antisense LncRNA主要存在与细胞核内行使调节功能，诸如低氧、血清饥饿、过氧化物等细胞压力因子的存在会改变核内Antisense LncRNA的存在模式，从而改变相应正义RNA的水平。 mRNA的编辑 Antisense LncRNA还会影响到mRNA编辑（图3Ac），如黑腹果蝇中的一个基因Rnp4f与其反义转录本Sas10，在它们的重叠区会对Rnp4f的mRNA进行腺苷脱氨基至肌苷的转换。果蝇的Sas-10 是Rnp4f 基因的Antisense LncRNA，二者形成双链RNA，在ADAR 的作用下使4f-rnp 的部分腺嘌呤转换为次黄嘌呤，并且导致4f-rnp mRNA 水平的降低。
图3.核内和胞质中正义-反义RNA相互配对形成二聚体 RNA-RNA胞质相互作用 这种机制是基于反义RNA和正义RNA在胞质内形成二聚体（如图3Ba-c），形成的发夹结构会影响正义mRNA的稳定性和翻译；或者，该二聚体可能会封闭miRNA结合位点；或这，作为发夹模板产生内源性siRNAs。 影响mRNA的稳定性和翻译 在胞浆中，Antisense LncRNA 通过与正义链mRNA 结合形成双链而影响后者的稳定性和翻译效率。两者的结合区域通过降低mRNA衰退、影响mRNA的稳定性；或者，mRNA此区域通过多种RNases进行一系列内外源核苷酸的剪切而降解。如β位点淀粉样蛋白前体裂解酶1(BACE1) 基因的Antisense LncRNA BACE1-AS 与BACE1 第6 外显子完全重叠，二者形成二聚体可能改变了BACE1的次级或三级结构，从而增强了BACE1 mRNA的稳定性。 当生物体遭受内外毒素、炎症反应等刺激时，诱导型一氧化氮合成酶(INOS) 会被大量合成，以产生足量的一氧化氮发挥多种调节作用。INOS 基因的天然Antisense LncRNA通过与人抗原HuR 相互作用，能够使INOS mRNA 免受核酸酶攻击，从而增强其稳定性，保证一氧化氮合酶的产生能满足细胞代谢的需要。HIF1αAntisense LncRNA αHIF 可以与其3′UTR 的序列结合，改变局部二级结构，使ARE 元件暴露，HIF1αmRNA 在核酸酶的作用下降解。 Antisense LncRNA还会抑制翻译，如B细胞成熟抗原（BCMA）基因的Antisense LncRNA抑制BCMA 翻译，却不会造成BCMA mRNA 水平的变化； 显然它是在翻译水平调控BCMA 的表达。另一个显著的例子是：转录因子PU. 1 的反义RNA 分子可以在翻译的起始和延伸之间抑制翻译的进行，形成的二聚体会影响与核糖体的结合，从而下调PU. 1 的表达，但对PU. 1 的mRNA 水平没有影响。 封闭miRNA结合位点 Antisense LncRNA与其相应正义RNA形成的二聚体会封闭miRNA 的结合位点来维持正义转录物的稳定性。以BACE1为例，其Antisense LncRNA不仅会增强BACE1 mRNA的稳定性（如前文），还会通过覆盖BACE1 mRNA 的miRNA 结合位点以阻止miRNA介导的翻译抑制。FANTOM3数据库报道，至少34%的天然Antisense LncRNA与正义mRNA 3’UTR区域可能形成二聚体；而mRNA 3’UTR区域往往含有miRNA作用的靶位点，所以天然Antisense LncRNA会与miRNA竞争结合3’UTR同一区域，以维持mRNA的稳定性。 内源siRNA的形成 Antisense LncRNA与其正义RNA形成的双链RNA，很可能会在Dicer 的加工下产生内源性siRNA，从而调控基因表达。如在拟南芥中发现一些蛋白编码基因及其反义RNA 可生成内源性siRNA，通过选择性的降解P5CDH mRNA，使细胞内的脯氨酸水平升高以增强拟南芥的抗盐碱。而且，拟南芥中64%以上的蛋白编码基因可以与相应的Antisense LncRNA结合会生成内源siRNA。 类似的发现还有，在X 染色体失活过程中，Tsix 与Xist 形成双链，并倾向形成siRNA；在小鼠卵母细胞中，也发现Antisense LncRNA形成内源性siRNA。该发现，从另一个方面诠释了Antisense LncRNA在转录后水平的调控作用及其与其它RNA 之间的相互关系。 结语 前文中，我们就Antisense LncRNA调节基因表达的功能机制提出了四种模型，并且每种模型都列举了详尽的例子予以阐述。在这四种模型中，如上文所述，转录碰撞模型是不常见的一种调控机制；核内和胞质RNA-RNA之间的相互作用会产生如RNA编辑、剪接等结果，但也不是Antisense LncRNA的主要调控方式。此外，在RNA与DNA相互作用模型中，Antisense LncRNA引起DNA甲基化缺乏大量文献的报道，这种调节可能仅仅发生在一些特定的发育阶段。相反，反义RNA引起的染色体重组可能是许多低拷贝Antisense LncRNA调控的最主要机制；在这种模型中，反义RNA修饰染色体结构，最终抑制有义基因的表达。尽管目前研究表明天然Antisense LncRNA参与多种基因调控通路，但其具体的分子特性目前尚不明确。 虽然目前对天然Antisense LncRNA产生及作用的机制并不完全清楚，但可以肯定的是：它的调控作用在人类基因组中无处不在。目前已有很多研究证实Antisense LncRNA对生物的生长发育和疾病的产生发展有重要的调控作用。如扰乱这些Antisense LncRNA的产生，则会扰乱正义RNA的正常表达，从而对机体生长发育及疾病等产生影响。深入挖掘这些Antisense LncRNA的调控机制必将为相关疾病的临床治疗带了新的突破口，为人类身体健康带来新的福祉。 |
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