新型冠状病毒肺炎（COVID-19）是由2019新型冠状病毒（2019-nCoV）感染引起的以肺部病变为主的新发传染病，可引起消化系统和神经系统的损伤，严重者可导致死亡［1］。 2019年12月以来，疫情进展迅速，截至2020年2月26日24时，我国（港澳台地区除外）累计报告确诊病例78497例，死亡病例2744例，全球疫情亦趋于严峻。  目前暂无针对2019-nCoV的有效治疗药物，疫苗也处于临床试验阶段，早期诊断、及时收治患者对有效控制疫情至关重要［2］。 《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第六版）》推荐实时荧光RT-PCR检测2019-nCoV核酸阳性是疑似病例确诊的诊断条件之一［3］，但该技术对实验场所及人员要求高、操作繁琐、耗时长，检测人员感染风险高，结果受标本质量、实验条件及人员操作等因素影响较大［4］，核酸单项检测并不能满足排查诊断的要求。  作为机体免疫系统抵抗病毒的重要效应分子，血清特异性抗体是诊断感染的另一关键证据。 抗体检测的操作简单便捷，对实验环境及人员要求不甚苛刻，仅需采集血液标本，很大程度上降低医护人员在标本采集和检测过程中被感染的风险，是快速筛查和核酸辅助诊断的重要手段［5］。 1 抗体产生特点机体在接触病毒时，IgM抗体产生最早，但浓度低、维持时间短、亲和力较低，是急性期感染的诊断指标；IgG产生晚，但浓度高、维持时间长、亲和力高，血清IgG阳性提示感染中后期或既往感染［6-7］。 2 抗体血清学检测方法目前临床中常用的抗体血清学检测方法有3种。 2.1 酶联免疫吸附试验法 2.2 化学发光免疫分析法 2.3 胶体金免疫层析法 3 抗体检测的灵敏度和特异度灵敏度反映诊断试验检出感染者的能力，若过低，会出现较多假阴性结果，影响疾病的诊断、干预和预后，严重可导致患者过早死亡； 特异度衡量诊断试验正确判断非感染者的能力，若过低，则会出现较多假阳性结果，导致医疗资源的浪费，并造成患者及群众的焦虑和恐慌。 因此，具有较高灵敏度和特异度是抗体检测技术的应用基础。 4 抗体检测假阴性及假阳性结果分析假阳性和假阴性结果会影响临床诊断。为提高2019-nCoV抗体检测的准确性，有必要对可能出现的结果及原因进行深入分析。 4.1 抗体检测假阴性 4.1.1 防腐剂和抗凝剂： 采用防腐剂叠氮化钠、抗凝剂EDTA等处理标本，会抑制辣根过氧化物酶（HRP）的活性，造成ELISA假阴性。 4.1.2 标本保存不当： 当标本在冰箱中保存过久时，血清中IgG聚合成多聚体，且抗体免疫活性减弱。 4.1.3 实验员操作失误或试剂盒保存不当： 试剂使用前未平衡至室温，试剂用量不足，温育时间或温度不足；试剂未按规定保存，受到污染或失效等［22］。 4.1.4 层析过快： 抗原抗体复合物尚未与检测线上的抗体结合，就越出检测线，造成GICA假阴性。 4.2 抗体检测假阳性 4.2.1 溶血或红细胞标本： 红细胞的细胞内液中各种酶可与底物发生非特异性反应，且血红蛋白中亚铁血红素与HRP活性类似，可催化底物，造成ELISA检测假阳性［23］；检测区堆积形成颜色较浅的非特异性条带，干扰目视法判定胶体金试纸结果［24］。 4.2.2 纤维蛋白的影响： 由于标本凝集不全或离心转速过低、时间太短，血清中的纤维蛋白未完全析出，形成的块状或絮状物堵塞洗板机头。 4.2.3 细菌污染标本： 菌体内可能含有内源性HRP，造成ELISA假阳性结果［23］；此外，疏水性的菌体碎片与金标粒子或捕捉抗体发生结合，影响GICA判读。 4.2.4 患者自身原因： 体内存在自身抗体、嗜异性抗体等，如患有某些基础疾病或免疫功能异常，或长期服用某种药物，可产生异常蛋白抗体或特殊物质，如类风湿因子、甲胎蛋白、补体等，具有一定吸附作用，造成抗体检测假阳性［25］。 5 核酸与抗体联合检测结果解读 核酸与抗体联合检测可提高诊断效率，当联合检测结果出现以下情况时，需要综合分析判断进行结果解读。 5.1 核酸检测阳性时，抗体检测出现阴性或阳性结果 5.1.1 核酸阳性，IgM和IgG均为阴性 患者可能处于2019-nCoV感染“窗口期”：“窗口期”是指从人体感染病毒后到外周血中能够检测出病毒抗体的这段时间，一般为2周。这段时间内无法检测血液中的病毒抗体，因此，IgM和IgG均为阴性。此时处于感染早期，病毒不断复制，核酸载量呈指数递增，达到核酸检测下限，核酸检测呈阳性［26-27］。核酸检测较血清抗体检测的优势在于缩短了感染检出窗口期，可及早发现感染者［28］。 5.1.2 核酸阳性，IgM阳性、IgG阴性 患者可能处于2019-nCoV感染早期，机体免疫应答最早产生抗体IgM，暂未产生IgG或IgG含量未达到诊断试剂的检测下限［29］。 5.1.3 核酸阳性，IgM阴性、IgG阳性 患者可能处于2019-nCoV感染中晚期或复发感染。病毒刚入侵人体之时，免疫系统首先会产生临时性抗体IgM，大约1个月后达峰值，随着时间的推移，侵入人体的病毒逐渐被IgM中和，IgM逐渐减少，直至低于检测下限；同时，人体免疫系统会产生持久性抗体IgG，在感染中晚期，IgG为机体免疫的主力军，浓度高，能够被检测到［30］。恢复期IgG较急性期增加4倍及以上时，可诊断为复发感染［5］。 5.1.4 核酸阳性，IgM阳性、IgG阳性 患者处于感染活跃期，但人体已对2019-nCoV产生一定免疫能力（持久性抗体IgG已产生）。 5.2 核酸检测阴性时，抗体检测出现阴性或阳性结果 5.2.1 核酸阴性，IgM阳性、IgG阴性 IgM阳性提示极大可能处于2019-nCoV感染急性期，此时需考虑核酸检测结果存疑。 出现核酸检测假阴性的原因及应对建议主要有以下几方面： （1）标本质量差。采集上呼吸道的口、鼻咽拭子等部位标本时，推荐采集鼻咽拭子进行病毒核酸检测，为了提高检测阳性率，建议采集同一患者多部位标本（口咽拭子、鼻咽拭子、鼻腔拭子等）合并检测；对于有消化道症状的疑似患者，可同时采集粪便或肛拭子进行检测［3］。 （2）标本采集保存不当，没有正确保存、运输和处理标本。推荐4 ℃运送标本（因RNA易降解）。 （3）技术本身原因，如病毒变异、PCR抑制等。由于2019-nCoV为单股正链RNA病毒，分子量大，具有易变异的特性，传播过程中可能会产生核酸序列的变异，若处于核酸扩增的引物结合区，就会出现假阴性结果［30］。建议针对多个核酸区域进行扩增，可有效避免核酸变异对检测结果的影响。因此，当核酸检测结果为阴性时，只可报告本次检测结果阴性，不可排除2019-nCoV感染，需多次重复确认［31］。 （4）患者有其他疾病，已发现类风湿因子引起IgM弱阳性或阳性的病例。 5.2.2 核酸阴性，IgM阴性、IgG阳性 提示患者可能既往感染2019-nCoV，但已恢复或体内病毒被清除，免疫应答产生的IgG维持时间长，仍存在于血液中而被检测到。 5.2.3 核酸阴性，IgM弱阳性、IgG阴性 提示患者初次感染载量极低的2019-nCoV并处于早期，病毒载量低于核酸检测下限，机体产生少量IgM，尚未产生IgG；或由于患者自身类风湿因子阳性等引起的IgM假阳性。 5.2.4 核酸阴性，IgM阳性、IgG阳性 患者近期曾感染2019-nCoV并处于恢复期，体内病毒被清除，IgM尚未减低至检测下限；或核酸检测结果假阴性，患者处于感染活跃期。 6 结语综上所述，相关医疗机构应尽早建立2019-nCoV血清抗体检测技术。 抗体检测可用于2019-nCoV核酸检测阴性疑似病例的补充检测或在疑似病例确诊时与核酸检测协同应用。 在COVID-19的不同疾病进展阶段，核酸和抗体检测的效率不尽相同，两者协同使用，可取长补短，提高诊断效率，监测疾病进展。 而正确解读联合检测结果，可提高2019-nCoV的快速诊断和鉴别诊断能力，更好地了解病毒载量和疾病进展，指导临床诊疗工作。 （收稿日期：2020-02-25） 参考文献略 第一作者  宁雅婷 北京协和医院临床检验诊断学专业在读研究生，《医学参考报微生物与感染频道》编辑。师从徐英春教授，主要研究临床光滑念珠菌实验室诊断、耐药机制及其分子流行病学。新型冠状肺炎疫情期间，高度关注新型冠病毒实验室诊断进展。 通信作者  徐英春 研究员、教授、博士研究生导师，北京协和医院检验科主任，临床生物标本管理中心主任，临床检验诊断学系主任。 主要学术兼职： 欧洲临床抗菌药物敏感实验委员会（EUCAST）华人抗菌药物敏感实验（ChiCAS）分委会主任委员，欧洲临床微生物感染疾病学会（ESCMID）合作实验室主任，世界华人检验舆病理医师协会副会长，国家卫生计生委抗菌药物临床应用与细菌耐药评价专家委员委员兼办公室主任，国家卫计委合理用药专家委员会抗菌药物组副组长，国家卫计委全国细菌耐药监测网质量管理中心负责人，中国医师协会检验医师分会常委。 原文来源：《新型冠状病毒血清特异性抗体检测技术应用探讨》「链接」 |
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