一文掌握结合生信数据挖掘的外泌体研究套路

前面给大家介绍了外泌体相关的文献，看过那2篇文章后你应该对外泌体相关的研究有了大概的了解（每周文献精读，通过这篇论文入门外泌体研究；节约时间成本，一文掌握4大热点的研究套路），今天继续跟大家读一篇外泌体相关的文献，这篇文章同样综合了多个热点，包括干细胞、外泌体、小分子RNA和生信分析，也是一篇非常适合学习的参考文献。

这篇文献题目是：

Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosomal MicroRNA-126-3p Inhibits Pancreatic Cancer Development by Targeting ADAM9.骨髓间充质干细胞来源外泌体MicroRNA-126-3p通过靶基因ADAM9抑制胰腺癌发展。文章2019年发表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》，影响因子是5.919。

原文PDF已经上传到公众号网盘，公众号主页回复“文献精读”可获取下载。

先来看研究背景：

主要交待了几个方面的内容：1. 胰腺癌的背景2.骨髓间充质干细胞(BMSCs)在胰腺癌治疗中的潜力；3. BMSCs来源的外泌体携带的miRNA在肿瘤中的作用；4.miR-126-3p在肿瘤中的作用；5.本研究的目的主要是研究BMSCs来源外泌体携带的miR-126-3p在胰腺癌中的作用。

研究方法：

作者首先是进行了GEO数据库挖掘筛选差异基因，利用miRNA靶基因预测网站预测靶基因。然后在体外培养了胰腺癌细胞，并收集了28个胰腺癌患者的组织和32个胰腺炎患者的组织样本。通过质粒慢病毒转染胰腺癌细胞分别过表达或沉默miR-126-3p、沉默ADAM9，用双荧光素酶报告试验验证miR-126-3p和ADAM9的关系，做了Edu染色和Transwell迁移试验检测胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。在体外培养BMSCs，提取外泌体并进行电镜观察、NTA分析和乙酰胆碱酯酶活性检测（AChE）。将胰腺癌细胞和BMSCs共培养，共聚焦显微镜观察，PCR和Western-blot检测相关RNA和蛋白表达。最后做了动物实验，进行BMSCs裸鼠体内移植。

我们来看研究结果

1.生信数据挖掘发现ADAM9是miR-126-3p的靶基因。

主要是分析了GEO数据库中的胰腺癌基因表达谱，做了韦恩图，用R软件limma包分析得到了GEO样本共有的差异表达基因ADAM9,然后通过5个miRNA靶基因预测网站（TargetScan , miRSearch, miRTarBase, miRWalk ,mirDIP；这几个网站的网址文中都作了注明）预测了miRNA的靶基因，发现ADAM9是miR-126-3p的靶基因，用了GEPIA平台分析ADAM9基因表达和胰腺癌患者生存率之间的相关性，

2.胰腺癌组织中miR-126-3p的表达是下降的。主要是用PCR检测了胰腺癌细胞和组织中miR-126-3p的表达。

3.过表达miR-126-3p能抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，促进代谢。这里面主要是分了4个组，miR-126-3p过表达组和对照组、miR-126-3p沉默组和对照组，Edu检测增殖、Transwell试验检测迁移和侵袭,流式细胞术检测凋亡率。

4.双荧光素酶报告试验、PCR和WB验证了ADAM9是miR-126-3p的直接靶基因。主要通过沉默或过表达胰腺癌细胞中的miR-126-3p，检测ADAM9的表达变化。

5.发现miR-126-3p是通过负调控ADAM9抑制胰腺癌细胞的生物学功能。分了4个组，空白转染组、miR-126-3p抑制剂+空白转染组、ADAM9转染沉默组、miR-126-3p抑制剂+ADAM9转染沉默组，检测了胰腺癌的细胞代谢、增殖、迁移和侵袭功能。

6. BMSCs的培养和鉴定。

7.证明了BMSCs来源的外泌体携带了miR-126-3p。包括了外泌体的提取和鉴定（电镜观察、NTA分析和WB检测标记物）；通过转染过表达BMSCs中miR-126-3p并进行红色荧光标记，然后与pCDNA3.1-GFP荧光转染标记的胰腺癌细胞共培养，在共聚焦显微镜下能观察到胰腺癌细胞中有红色标记的miR-126-3p，用PCR检测了BMSCs、外泌体和胰腺癌细胞中miR-126-3p的表达，并用PCR和WB检测了胰腺癌细胞中ADAM9的表达。

 

8.外泌体释放抑制剂GW4869通过抑制BMSCs外泌体的释放（通过AChE检测）抑制了胰腺癌细胞中miR-126-3p的表达，促进了胰腺癌细胞的迁移和侵袭。

9. BMSCs来源外泌体通过传递miR-126-3p影响胰腺癌细胞生物学功能。

通过过表达BMSCs中的miR-126-3p,然后与胰腺癌细胞共培养，通过Edu检测增殖、流式细胞术检测凋亡率、Transwell试验检测迁移和侵袭、WB检测细胞增殖和侵袭因子（MMP-14、COX2、VEGF、Ki67）等方法检测胰腺癌细胞的功能变化。

10.过表达miR-126-3p抑制了胰腺癌的肿瘤增长和代谢。这部分就是动物体内试验，把经过miR-126-3p过表达处理的BMSCs移植到裸鼠体内，检测肿瘤的组织变化和相关因子（ADAM9、MMP-14、COX2）的表达。

11. 研究结果总结。作者最后画了一个漂亮的机制图来展示本研究的结果。

结果总结：

本研究表明，BMSCs来源的外泌体可以通过传递miR-126-3p靶向抑制ADAM9的表达，从而抑制胰腺癌的进展。

从这篇文章来看，重点要学习的几个点：

1. 生信数据挖掘分析：GEO数据挖掘找差异基因，韦恩图制作，limma R包分析差异基因，5个miRNA靶基因预测网站

2. 双荧光素酶报告试验：确定miRNA和预测的靶基因之间的直接关系

3. 细胞共培养技术：BMSCs与疾病细胞的共培养

4. 外泌体释放抑制的方法，可以用抑制剂GW4869抑制细胞外泌体的释放。

5. 外泌体传递miRNA的研究套路：BMSCs中的miRNA沉默与过表达，目的细胞靶基因的转染沉默。

6. 机制模式图的绘制：一张图总结研究结果，可以给你的文章加分很多。

这篇文章如果凝练成基金课题，可以用下面的题目：
BMSCs外泌体传递miR-126-3p靶向调控ADAM9抑制胰腺癌进展的机制研究

如果想做大一点可以把ADAM9去掉，变成下面的题目：

BMSCs外泌体传递miR-126-3p抑制胰腺癌进展的机制研究

今天的分享就到这里了。下期再见。

本文作者

逍遥君：南京医科大学博士，主治医师，发表论文20余篇，第一作者或通讯作者SCI论文8篇，主持国自然及各级别课题多项，著有《逍遥君说科研系列课程》，主讲Meta分析、基金标书、论文写作，丁香园、募格学术特约讲师，同时具有多年基金、股市、P2P、数字货币投资经验。

欢迎来稿分享你的医学故事和经验，稿件请发送给微信：medical2006

本号建有3个微信科研群，还有1个理财群，1个VIP课程群和1个情感交友群，欢迎加入，加群请联系微信：medical2006，只接受医学生、医务人员加群，广告、传销和金融骗子勿扰。