高考总复习基因工程专题
编稿：宋辰霞审稿：闫敏敏
【考纲要求】
1．总结基因工程所需的三种基本工具的特点及作用。2．概述基因工程基本操作程序的四个步骤。3．简述蛋白质工程的原理及过程。【考点梳理】
考点一、基因工程的概念
基因工程：也叫基因拼接技术或DNA重组技术，指按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另外一种生物的细胞中，定向改造生物遗传性状的过程。
基因工程是生物工程中的核心技术，它与其他生物技术的关系如下：
考点二、基因工程的三种基本工具
1.限制性核酸内切酶——基因的剪刀在生物体内有一类酶，它们能将外来的DNA切断，但对自己的DNA没有损害作用。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性核酸内切酶，简称限制酶。
（1）来源：主要来自于原核生物——细菌
（2）特点——专一性
①含义：限制酶的专一性是指其可识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并在特定部位对DNA分子进行切割。
②意义：使限制酶可准确切割的所需的目的基因。
（3）作用部位：限制酶的作用部位为脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键，即下图①位置所示的化学键。②位置所示的化学键也是磷酸二酯键，但位于一个脱氧核苷酸内部，不是限制酶的作用部位。
（4）产生末端的类型及特点：
①类型：限制酶在对DNA双链进行切割时，按照切割的方式，可以分为错位切和平切两种，可产生两种末端：黏性末端、平末端。
黏性末端，如下图：
错位切是在两条链的不同部位进行切割，之间相隔几个核苷酸，切开后形成的两个末端有一截为单链，这样的末端可通过其单链上碱基的互补配对相互连接，故称为黏性末端。
平末端，如下图：
平切是在两条链的相同部位进行切割，形成两个无黏性末端的平口，称平末端。
②特点：同一限制酶切割DNA双链形成的末端相同，且为黏性末端时，可通过碱基互补配对相连接。
如上面的EcoRI限制酶，切割所得的末端均为：（右边的末端“向左翻转，再向上翻转”后可看出其实它与左边的末端是相同的），且它们之间可通过碱基互补配对相连接。
这与限制酶识别的序列具有回文性有关：
限制酶识别的DNA序列具有回文性，又称为回文序列，即分别从不同方向读取两条链上的碱基序列时，读取的结果相同。EcoRI限制酶识别的序列便如此：
2.基因工程中的运载体
（1）运载体的种类：质粒、噬菌体、动植物病毒运载体的化学本质为DNA，可以与目的基因（DNA片段）连接，最常用的运载体为质粒。
质粒主要存在于细菌细胞质，酵母菌中也有，它是一种相对分子质量较小、独立于拟核或染色体DNA之外的环状DNA。质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。
（2）基因工程对运载体的要求①需有启动子和终止子 使目的基因可成功表达 ②具有复制原点 使运载体具备自我复制的能力，或整合到受体DNA上随DNA的复制而复制③带有标记基因以便④运载体必需有一个或多个限制酶的切割位点以便目的基因可以插入到载体上去①这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，必须在需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。②切割运载体与提取目的基因所用的限制酶应相同，这样运载体和目的基因便会有相同黏性末端，有利于它们的连接。
③双酶切法：切割运载体与目的基因所用的限制酶应为相同的两种酶，这样可以防止运载体与目的基因发生自身环化现象或任意连接。 要点诠释：
①运载体需具有以上特点，重要目的之一是使目的基因与之结合后，可成功表达，所以运载体与目的基因结合后形成的重组DNA分子也称为“基因表达载体”。其组成包括目的基因、标记基因、启动子、终止子、复制原点等，如下图：
?
②实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。
酶的种类 作用 应用 是否参与基因工程 相同点 DNA连接酶 连接DNA片段，在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 用于基因表达载体的构建，使目的基因与运载体连接 参与 ①化学本质都是蛋白质。
②均属于酶，具有酶的基本属性和特点。 限制酶 使特定部位的磷酸二酯键断裂 用于提取目的基因和切割载体 参与 DNA聚合酶 将单个脱氧核苷酸加到已有的核酸片段的3’末端的羟基上，形成磷酸二酯键 用于DNA复制过程 不参与 ?
考点四、基因工程的步骤
基本操作步骤为：提取目的基因→目的基因与运载体结合→将目的基因导人受体细胞→目的基因的检测与表达
1、提取目的基因
目的基因可直接从目的基因供体中提取，但常用的方法为以下3种：
（1）从基因文库获取基因①基因文库的概念：用重组DNA技术将某种生物细胞的总DNA或染色体的所有片段随机连接到基因载体上，然后转移到适当的宿主细胞中。通过细胞增殖而构成各个片段（基因）的无性繁殖系（克隆），这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。
②基因文库的种类：可以分为基因组文库和cDNA文库（部分基因文库）。基因组文库可包含一种生物的所有基因，而cDNA文库只包含了一种生物的部分基因。
（2）PCR技术扩增目的基因PCR是聚合酶链式反应，它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列的聚合及扩增。它包括3个基本步骤，如下图：
①变性：双链DNA片段在94℃下解聚为单链；
②复性（退火）：两种引物在适当温度（50℃左右）下，与模板DNA的目的序列通过碱基互补配对形成氢键，而结合；
③延伸：温度为热稳定DNA聚合酶的最适温度（72℃），在模板DNA、引物、dNTP（提供原料：四种脱氧核苷酸）、适宜缓冲液（Mg2＋）构成反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对引物（引物1、引物2）所界定的DNA片段进行扩增。
要点诠释：
①PCR技术扩增DNA片段是通过上述三步反应的不断循环完成的。由于每一循环所产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR产物是以指数方式增加，理论上每一轮循环可使DNA数量增加一倍。如经过20个循环后，特定DNA片段的数量在理论上可增加约106倍，从而实现了体外DNA分子的大量迅速扩增。
②在开始几个循环中含有长短不一的产物，但在以后的循环直至最终产物均是以两个引物界定的DNA片段为主。图示如下：（3）人工合成目的基因化学合成法：基因比较小，且核苷酸序列可知时，可用化学方法来人工合成。
反转录酶法：经反向转录酶的作用，以mRNA为模板获得与mRNA顺序互补的DNA单链，然后再复制形成双链DNA（cDNA）。反转录操作步骤如下：
2、目的基因与运载体结合（基因表达载体的构建）：
（1）所需酶：
限制酶：对目的基因和运载体进行切割。
DNA连接酶：连接目的基因与运载体。
3、目的基因导入受体细胞：
（1）大肠杆菌是应用广泛的受体细胞。因为其为单细胞、繁殖快、遗传物质相对较少；
植物细胞 动物细胞 微生物细胞 常用方法 农杆菌转化法（双子叶植物、裸子植物）
基因枪法（单子叶植物）、
花粉管通道法 显微注射法 CaCl2处理法 受体细胞 体细胞 受精卵 原核细胞 转化过程 农杆菌转化法：
目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的染色体DNA上→表达 目的基因表达载体提纯→取卵（受精卵）→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物 Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子 4、目的基因的检测和表达
检测方法 （1）检测目的基因是否存在：DNA分子杂交?（2）检测是否转录出mRNA：DNA-RNA分子杂交（3）检测是否翻译成蛋白质：抗原-抗体杂交 分子水平检测 目的基因是否表达
（1）抗病抗虫接种实验
（2）对基因产品与天然产品的功能进行比较 个体水平检测
考点五、基因工程的应用及基因工程的安全性
1.基因工程的应用
（1）基因工程与生产
①医药生产：利用基因工程菌等生产的药物有：人生长激素，干扰素等60余种。②基因工程育种：将苏云金杆菌的毒蛋白基因转移到棉花体内育出抗虫棉，培育高蛋白含量的马铃
薯和玉米、能产生大豆蛋白的水稻、耐储藏的西红柿、发光的烟草等。
（2）基因工程与健康①基因诊断：目前能够进行基因诊断的遗传病有数十种，苯丙酮尿症是其中之一。
②基因治疗
（3）基因工程与环境①转入抗虫基因的作物，可以减少使用农药。②科学家创造出多种“超级菌”，有的能分解污染陆地和海洋的石油，有的能“吞噬”汞，有的能降解农药DDT。③研究和培育能分解纤维素和木质素的细菌，以便利用稻草、木屑、植物秸秆、食物下脚料等生产酒精，改变能源结构；④培育能够处理工业废水、废气和废渣的细菌，以便从三废中回收贵重金属和有毒物质，变废为宝。
2.基因工程的安全性（1）转基因食品安全问题①可能含有已知或未知的毒素，对人体产生毒害作用。②可能含有已知或未知的过敏源，引起人体的过敏反应。③食品某些营养成分或营养质量可能产生变化，使人体出现某种病症。
（2）环境安全―――影响生态系统的结构和功能①转基因植物演变成农田杂草（超级优势物种）可能影响食物链和食物网的稳定②基因漂流到近缘野生种的可能性③转基因植物分泌物可能对环境造成影响
考点六、蛋白质工程
1、蛋白质工程的崛起的缘由
基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，而蛋白质工程是可生产符合人们生活需要且自然界尚不存在的蛋白质。
2、蛋白质工程的概念
以蛋白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。
3、蛋白质工程的基本原理
蛋白质工程的目标——根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。
基本途径——从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相对应的脱氧核苷酸序列（基因）。其流程图如下：
表示天然蛋白质合成过程
表示蛋白质工程流程图
要点诠释：
（1）蛋白质工程中，目的基因的获取只能用人工合成的方法。
（2）由于密码子具有“简并性”，故由某种特定氨基酸序列所推测出的脱氧核苷酸序列可有多种，即推测所得的基因可有多种。
4、蛋白质工程与基因工程的比较
项目 蛋白质工程 基因工程
区别 过程 预期蛋白质功能→设计蛋白质结构→推测氨基酸序列→推测脱氧核苷酸序列→合成DNA→表达出蛋白质 获取目的基因→构建重组载体→导入受体细胞→目的基因的表达与鉴定 实质 定向改造或生产人类所需蛋白质 定向改造生物的遗传特性，以获得人类所需的生物类型或生物产品（基因的异体表达） 结果 生产自然界没有的蛋白质 生产自然界中已有的蛋白质
联系 蛋白质工程是在基因工程的基础上，延伸出来的第二代基因工程。因为对现有蛋白质的改造或制造新的蛋白质，必须通过基因修饰或基因合成实现
【典型例题】
类型一、基因工程的工具及操作步骤
A.B淋巴细胞与肿瘤细胞融合，杂交瘤细胞中含有B淋巴细胞中的抗体基因
B.将人的干扰素基因重组到质粒后导入大肠杆菌，获得能产生人干扰素的菌株
C.用紫外线照射青霉菌，使其DNA发生改变，通过筛选获得青霉素高产菌株
D.自然界中天然存在的噬菌体自行感染细菌后其DNA整合到细菌DNA上
【答案】B
【解析】A项为动物细胞工程中的细胞融合技术，C为诱变育种，D非人为操作，只有B为基因工程，获得了能产生干扰素的工程菌。
【点评】本题较简单，主要考查对基因工程、细胞工程，及育种方式等概念的理解。
举一反三：
【高清课堂：基因工程407904典型例题2（获取目的基因的方法）】
【变式1】在已知某小片段基因碱基序列的情况下，获得该基因的最佳方法是（）
A.用mRNA为模板逆转录合成DNA
B.以4种脱氧核苷酸为原料人工合成
C.将供体DNA片段转入受体细胞中，再进一步筛选
D.由蛋白质的氨基酸序列推测mRNA
【答案】B
【解析】该基因较小，且序列已知，故最佳方法为人工合成法。
【变式2】对照下图，有关基因工程的工具酶功能的叙述，正确的是（）
A．切断a处的酶为限制性内切酶?B．连接a处的酶为DNA聚合酶C．连接b处的酶为DNA连接酶?D．作用b处的酶为限制性内切酶
【答案】A
【高清课堂：基因工程407904典型例题6】
例2．请回答基因工程方面的有关问题：
（1）关于基因工程的工具：
①构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图1中的处，DNA连接酶作用于图1中的处。（填序号）
②用限制酶EcoRV、Mbol单独或联合切割同一种质粒，得到的DNA片段长度如下图2（1kb即1000个碱基对），请画出质粒上EcoRV、Mbol的切割位点，并标出酶切位点之间的距离。
（2）利用PCR技术扩增目的基因：
①PCR过程需要_____________酶，作用于图3步骤。
②如果延伸时间设置较长，在第轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段，复制方式为______________。
③如图4所示，箭头代表子代DNA的延伸方向，我们可以根据已知DNA序列复制未知DNA序列，TDNA片段基因序列已知，设计4段TDNA的引物A、B、C、D，引物的作用是，如果利用PCR技术扩增TDNA片段，我们可选择作为引物（填字母）；如果扩增未知基因可选择作为引物（填字母）。
④设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理，两组引物如下图5所示，请说明不合理的理由。
第1组：；
第2组：。
⑤PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下图6的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为。
（3）获得转基因植株（图7）
①在构建重组质粒时，应选用图中限制酶对进行切割，以保证重组DNA序列的唯一性。
②为筛选出导入了重组质粒的农杆菌，应在培养基中加入。
③将转入抗旱基因的水稻细胞培育成完整的植株需要用技术，该技术包括图7中①、②过程。
【答案】
（1）①①处；①处②如下图：
（2）①耐高温的DNA聚合酶（Taq）；延伸；②三；半保留复制
③为DNA复制提供起点，因为DNA聚合酶没有起始复制的功能只有延伸复制的功能I和引物Ⅱ局部发生碱基互补配对而失效
第2组：引物I的局部碱基互补配对后发生自身折叠而失效
⑤DNA聚合酶只能使单个脱氧核苷酸连续结合到引物链上
（3）①HindIII和EcoRI；质粒和含抗旱基因的DNA片段②氨苄青霉素
③植物组织培养技术；脱分化；再分化
【解析】
（1）①限制酶与DNA连接酶均作用于连接两个脱氧核苷酸的磷酸二酯键；②由图可知EcoRV在质粒是有1个切割位点、Mbol在质粒上有2个切割位点，它们两个共同切割质粒可将之切割为3段；
（2）①②PCR技术即DNA的体外复制，也是半保留复制，需要耐高温的DNA聚合酶，即Taq酶，在延伸过程中起作用。PCR技术的第3轮开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段。③④⑤由于DNA聚合酶不能从头合成DNA子链，只能从引物的3，延伸子链，引物可为DNA复制提供起点；DNA聚合酶合成子链的方向为5，→3，，所以要扩增TDNA片段，需选择A、C作为引物，要扩增未知基因则需选择B、D作为引物。PCR技术需要一对引物，它们需通过碱基互补配对与模板链结合，不可发生自身的碱基互补配对，它们之间的也不可发生碱基互补配对。
（3）构建重组质粒时，需要用限制酶切割质粒和含目的基因的片段，切割时不可破坏DNA上有用的部分（如目的基因、标记基因等），另外还需用双酶切法，即用相同的两种限制酶切割质粒和含目的基因的片段，以避免质粒和目的基因发生自身环化和任意连接的现象；
【点评】本题考查基因工程的工具及操作过程，综合性较强。
举一反三：
【变式1】（2015新课标II）已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质（P1）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。回答下列问题：
从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的进行改造。
以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰基因或合成基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：。
（3）蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过和，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物进行鉴定
【答案】（1）氨基酸序列（或结构）
（2）PP1DNA和RNA
DNA→RNA、RNA→DNA、RNA→蛋白质（或转录、逆转录、翻译）
（3）设计蛋白质结构
推测氨基酸序列
功能
【解析】（1）蛋白质不同的结构，决定不同的功能，所以可以通过改变蛋白质的结构来实现改变功能。
（2）这道题我们可以根据题意，修饰的是P基因，合成的是P1基因。
中心法则的全部内容为：DNA和RNA的复制、转录、逆转录和翻译过程。
（3）蛋白质工程的基本途径：从预期的蛋白质功能出发→设计预期的蛋白质结构→推测应有的氨基酸序列→找到相应的脱氧核苷酸序列。通过蛋白质工程合成的蛋白质，还需要进行生物活性的鉴定即功能鉴定，检查是否达到人们的需求。
类型二、基因工程的应用及基因工程的安全性HIV属于逆转录病毒，是艾滋病的病原体。回答下列问题：
（1）用基因工程方法制备HIV的某蛋白（目的蛋白）时，可先提取HIV中的，以其作为模板，在的作用下合成。获取该目的蛋白的基因，构建重组表达载体，随后导入受体细胞。
（2）从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，刺激机体产生的可与此蛋白结合的相应分泌蛋白是。该分泌蛋白可用于检测受试者血清中的HIV，检测的原理是。
（3）已知某种菌导致的肺炎在健康人群中罕见，但是在艾滋病患者中却多发。引起这种现象的根本原因是HIV主要感染和破坏了患者的部分细胞，降低了患者免疫系统的防卫功能。
（4）人的免疫系统有癌细胞的功能，艾滋病患者由于免疫功能缺陷，易发生恶性肿瘤。
(2)抗体抗原抗体特异性结合
（3）T
（4）消灭
【解析】（1）提取HIV中的RNA，为了获得目的基因，以RNA作为模板，逆转录酶的作用下合成DNA获取该目的基因，构建基因表达载体，导入受体细胞。
（2）从受体细胞中分离纯化出目的蛋白，该蛋白作为抗原注入机体后，
（3）HIV病毒的靶细胞是人体中的T细胞，侵染之后，导致部分T细胞被破坏，降低了患者免疫系统的防卫功能。。xx。k.Com]
（4）人体的免疫系统有三大功能，防卫，监控和清除，艾滋患者易发恶性肿瘤原因是免疫系统监控，清除癌细胞的功能缺陷。
【点评】考查基因工程的原理和技术。
举一反三：
【变式1】T-DNA可能随机插入植物基因组内，导致被插入基因发生突变。用此方法诱导拟南芥产生突变体的过程如下：种植野生型拟南芥，待植物形成花蕾时，将地上部分浸入农杆菌（其中的T-DNA上带有抗除草剂基因）悬浮液中以实现转化。在适宜条件下培养，收获种子（称为T1代）。（1）为促进植株侧枝发育以形成更多的花蕾，需要去除，因为后者产生的会抑制侧芽的生长。（2）为筛选出已转化的个体，需将T1代播种在含的培养基上生长，成熟后自交，收获种子（称为T2代）。（3）为筛选出具有抗盐性状的突变体，需将T2代播种在含的培养基上，获得所需个体。（4）经过多代种植获得能稳定遗传的抗盐突变体。为确定抗盐性状是否由单基因突变引起，需将该突变体与___________植株进行杂交，再自交___________代后统计性状分离比。（5）若上述T-DNA的插入造成了基因功能丧失，从该突变体的表现型可以推测野生型基因的存在导致植物的抗盐性___________。【答案】（1）顶芽；生长素?（2）（一定浓度的）除草剂?（3）（一定浓度的）盐?（4）野生型；1?
（5）降低?
【变式2】下列关于转基因生物安全性的叙述，错误的是（）
A.种植转基因作物应与传统农业种植区隔离
B.转基因作物被动物食用后，目的基因会转入动物体细胞中
C.种植转基因植物有可能因基因扩散而影响野生植物的遗传多样性
D.转基因植物的目的基因可能转入根系微生物
【答案】B
【解析】转基因作用被食用后会被消化分解，目的基因不会转入动物体细胞。
【变式3】下列关于基因工程应用的叙述，正确的是（）A．基因治疗就是把缺陷基因诱变成正常基因B．基因诊断的基本原理是DNA分子杂交C．一种基因探针能检测水体中的各种病毒D．原核基因不能用来进行真核生物的遗传改良【答案】B
【解析】本题考查基因工程的应用。基因治疗是把健康的外源基因导入到有缺陷基因的细胞中；一种基因探针能检测相应的某一种特定的病毒；原核基因可以用来进行真核生物的遗传改良，例如用苏云金芽孢杆菌的抗虫基因改良棉花。
类型三、蛋白质工程
（该序列中，1链与2链从不同方向读取时碱基序列相同：
1链从左往右读是GAATTC；2链从右往左读也是GAATTC，
这样识别GAATTC序列的限制酶便可将该DNA的两条链均切断，
切割所得的末端均相同，且可通过碱基互补配对相连接。）
2链
1链
补充知识，了解即可：
基因工程是在DNA上进行的分子水平的设计和施工，操作对象是基因，最终需要使目的基因在被改造的生物中表达，使被改造的生物具有人们所希望的性状。
一、真核生物的cDNA文库中的目的基因是根据mRNA反转录获得的，不含有启动子、内含子序列等，而基因组文库中的目的基因是直接从生物中得来的，含有启动子、内含子序列等。
二、基因真核生物与原核生物的基因有以下区别：
1.原核生物的基因组成：原核生物基因分为编码区、非编码区，如下图：
编码区与非编码区的定义：编码区指基因上能转录为相应的信使RNA，进而指导蛋白质的合成的部分，即能够编码蛋白质的部分。
非编码区则相反，不能编码蛋白质，但是其对遗传信息的表达必不可少，其上有调控遗传信息表达的核苷酸序列，如启动子和终止子。编码区与非编码区的位置：
非编码区位于编码区的上游及下游。在调控遗传信息表达的核苷酸序列中最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。RNA聚合酶催化DNA转录为RNA，能识别调控序列中的结合位点，并与其结合。2.真核生物的基因组成：真核细胞的基因也由编码区、非编码区组成，但比原核细胞的基因复杂些，如下图：
真核细胞基因在非编码区上，同样有具调控作用的启动子和终止子，与原核细胞基因的不同之处在编码区，其编码区是间隔的、不连续的，被不能编码蛋白质的序列（编码区上能够编码蛋白质的序列叫做外显子，不能编码蛋白质的序列叫做内含子）分隔开来成为一种断裂的形式。
第3个循环开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段（两个引物界定长度的DNA片段）
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