Nature Biotech | 遗传所高彩霞研究组建立植物基因组引导编辑技术体系“Plant Pr...

基因组编辑技术可以定向修饰植物基因组，从而大大加速植物育种的进程，是实现作物精准育种的重要技术突破。然而，作物的许多重要农艺性状是由基因组中的单个或少数核苷酸的改变或突变造成的。基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑，可利用外源修复模板通过同源重组介导的修复方式（HDR）实现目标基因特定核苷酸的改变。目前，同源重组在植物中的效率非常低，很难以此方式实现高效、稳定的植物基因组的精准编辑。

CRISPR系统所衍生的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器，可以分别在基因组靶向位点实现C:G>T:A或A:T>G:C的碱基替换。然而，碱基编辑技术还不能实现 C:G>A:T和A:T>C:G 和C:G>G:C和A:T>T:A 的碱基替换，更不能实现片段的精准插入和删除。因此，植物育种和基因功能研究迫切需要可以高效、精准实现任意碱基替换、增添或删除的基因组定向编辑技术体系。 

2019年10，哈佛大学David Liu实验室在Nature杂志上发表了题为Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA的论文，开发出了全新的精准基因编辑工具PE （Prime Editors）。新工具PE无需额外的DNA模板便可有效实现所有12种单碱基的自由转换，而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除（最多可插入44bp的碱基，可删除80bp的碱基），这一全能性的工具为基因编辑领域带来了重大变革。新工具PE是以CRISPR-Cas9系统为基础，在两方面加以改造：首先是改造单链引导RNA（sgRNA），其3’末端增加了一段RNA序列，新获得的RNA被称作pegRNA；第二则是将Cas9切口酶（H840A突变型，只切断含PAM的靶点DNA链）与逆转录酶融合获得新的融合蛋白。pegRNA的3’端序列有双重角色，一段序列作为引物结合位点（PBS），与断裂的靶DNA链3’末端互补以起始逆转录过程，另一端序列则是逆转录的模板（RT模板），其上携带有目标点突变或插入缺失突变以实现精准的基因编辑

2020年3月16日，Nature Biotechnology在线发表了中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究组与David R. Liu研究组的合作论文，题为“Prime genome editing in rice and wheat”。该研究成功建立并优化了适用于植物的引导编辑系统（Plant Prime Editing，PPE），并在重要农作物水稻和小麦基因组中实现精确的碱基替换、增添或删除。 

该研究首先通过PPE系统在水稻和小麦原生质体中实现了16个内源位点的精准编辑，包括12种类型的单碱基替换、多碱基替换、小片段的精准插入和删除，编辑效率最高可达19.2%。进一步研究发现，该系统的编辑效率受到PBS和/或RT模板长度以及nicking sgRNA位置的影响。对PPE系统进行了一系列的优化后，发现37℃条件下培养可以显著提升该系统的编辑效率(1.6倍)，通过引入核酶对pegRNA进行自加工，也可以在部分位点提高编辑效率。此外，来源于植物花椰菜花叶病毒和大肠杆菌retron系统的逆转录酶可以与nCas9融合在植物中实现精准引导编辑。最后，该研究通过PPE成功获得了单碱基突变、多碱基突变及精准删除的水稻突变体植株，效率最高可达21.8%，这些突变均难以通过现有的基因编辑系统实现。虽然Plant Prime Editing系统在部分位点上C:G>T:A或A:T>G:C的效率低于单碱基编辑系统，但是该系统可以实现所有类型的碱基置换，以及碱基增加和删除。PPE极大地扩展了植物基因组编辑范畴，为植物基因组功能解析及实现作物精准育种提供了重要技术支撑。 

高彩霞组博士生林秋鹏、博士后宗媛以及博士生薛郴销为该论文的共同第一作者，高彩霞研究员为本文的通讯作者。