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尽管在早期疾病的检测和治疗方面取得了重大进展，但转移仍然是与乳腺癌相关的几乎所有死亡的原因。以前的研究表明，转移是由具有独特生物学特性的罕见原发肿瘤细胞播下种子，使它们能够超越转移级联的每一步。虽然促进细胞运动和迁移的特性已经得到了很好的研究，但对远端组织中微转移的播散和建立机制了解甚少。这在一定程度上是因为转移性种子无法在人类身上进行研究，也因为在动物模型的这一短暂阶段检测和分析罕见细胞在技术上具有挑战性。对转移性播种机驱动机制的进一步研究对于激发预防转移性扩散和降低乳腺癌患者死亡率的新战略至关重要。 2020年3月，美国加州大学欧文分校生理与生物物理学系研究者在NATURE CELL BIOLOGY杂志上发表了题为“Transcriptional diversity and bioenergetic shift in human breast cancer metastasis revealed by single-cell RNA sequencing”的文章，该研究中作者利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术捕获和分析在人类患者衍生的异种移植(PDX)模型中微转移过程中的单个癌细胞。这使他们能够研究肿瘤异质性在转移中的作用，并确定促进转移的微转移细胞中上调的细胞程序。他们发现微转移表现出一个独特的转录组程序，并确定线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)是转移播种期上调的主要途径。作者进一步发现，使用两种不同的乳腺癌转移实验模型，OXPHOS的药理抑制作用，特别是在癌细胞中，可以减弱肺中的转移种子。数据说明氧化磷酸化的药理学抑制作用显著减弱了肺转移性播散，这表明了氧化磷酸化在转移中的功能重要性，并突出了其作为一个治疗靶点的潜力，以防止乳腺癌患者的转移性扩散。 首先为了确定在转移性组织中播散重要的基本细胞程序，作者研究了在播散和建立微转移病灶期间癌细胞唯一表达的转录组程序。利用了PDX乳腺癌模型，因为它们具有人类疾病的真实性，包括肿瘤内部的异质性，这对于确定细胞异质性在转移中的作用至关重要。首先作者分析了三种先前建立的三阴性乳腺癌(TNBC) PDX模型:HCI001、HCI002和HCI010。与许多乳腺癌患者一样，在这些模型中，转移进展缓慢且具有偶发性，其中大多数动物在肺和淋巴结中表现出弥散性微转移，且终末转移负担非常低。 作者之前开发了一个从PDX模型中分离转移细胞的稳健方案，使用的是人类(CD298)和小鼠(MHC-I)种特异性抗体的流式细胞术。在这里，他们使用这种方法来比较细胞多样性的原发肿瘤和微转移的scRNA-seq。从PDX小鼠的肺、淋巴结和原发肿瘤中分离出单个癌细胞，并将其放入96孔PCR板中。从每只动物中分离出匹配的转移和原发肿瘤细胞。作者针对流式细胞术分类的癌细胞优化了scRNA-seq方案。利用Illumina平台构建单细胞库，并进行深度测序。与高通量平台(例如，基于液滴的)相比，这种深度测序协议使我们能够捕获罕见的转移细胞，并在每个细胞中检测到更多的基因。作者总共对来自9只PDX小鼠和3个肿瘤模型的1707个肿瘤和转移细胞进行了测序。 图一：微转移和原发肿瘤细胞的单细胞RNA测序 随后作者330个基因签名进行了GO - term分析，以识别转移播种期癌细胞中上调的通路和细胞特性。微转移细胞最常见的GO - term包括表皮发育(CALML5、KRT17、KRT16、KRT14和KLK5)和对未折叠蛋白的反应(DNAJA1、HSPA8、HSPB1、HSPE1和HSPD1)。有趣的是，许多顶级的GO - term集中在线粒体生物学和代谢，包括呼吸电子传递链，ATP代谢过程，线粒体运输和氧化磷酸化。相比之下，典型糖酵解和丙酮酸代谢过程是原发肿瘤细胞的主要代谢过程，这表明原发肿瘤和微转移细胞之间存在明显的代谢差异。GO term相关基因分析显示，与OXPHOS、糖酵解和线粒体复合物相关的基因有27个差异表达。 作者还评估了与37种代谢途径相关的1402个基因的表达，如戊糖磷酸途径、柠檬酸循环和脂肪酸代谢，以进一步研究原发肿瘤细胞和微转移之间的代谢差异。各途径的基因评分结果显示，糖酵解(P= 2.20 ×10-16)和OXPHOS (P= 2.20 ×10-16)是37种途径中差异表达最显著的。重要的是，发现在37个途径中，有33个途径检测到了70%的>基因，并通过了质量筛选，这表明在代谢途径中有足够的覆盖率，可以进行比较分析。接下来，作者进行了几项研究，对原发肿瘤细胞和微转移细胞之间的代谢差异进行了分子验证。结果发现HCI010原发肿瘤包含TMRMhigh和TMRMlow两种细胞群，其中TMRMhigh细胞群为次要细胞群。用TMRM对6只HCI010 PDX小鼠的原发肿瘤和肺细胞悬浮液进行了染色。细胞与活性染料(Sytox)、CD298、MHC-I和MitoTracker共染色，以识别活细胞，并评估线粒体膜相对于线粒体质量的电位。流式细胞术分析显示，微转移的线粒体膜电位比原代肿瘤细胞高3倍。这些数据，结合转录组分析，提示微转移利用较高水平的OXPHOS进行细胞代谢。 图二：微转移细胞线粒体OXPHOS增多 接下来，作者研究了OXPHOS的增加是对转移的功能重要还是仅仅代表了对转移部位氧供应增加的反应。使用了两种实验转移模型，即小鼠4T1和人类MDA-MB-231细胞，它们在静脉给药后转移到肺部，并具有可重现的动力学。使用复杂的V抑制剂寡霉素在体外抑制OXPHOS，然后测量其对肺转移瘤生长的影响，利用海马XF实验，我们发现寡霉素可导致氧耗率(OCR)的持续降低和细胞外酸化率的相应增加，提示细胞从氧化转变为糖酵解。作者进一步利用NADH的相量荧光寿命成像(FLIM)来确定代谢转移的持久性。处理24小时后的flim624分析显示，结合NADH显著降低，表明两个细胞系中都发生了持久的从OXPHOS向糖酵解的转移。总之，这些数据表明，寡霉素诱导MDA-MB-231和4T1细胞在不影响细胞生存力或增殖的情况下从氧基转变为糖酵解代谢。 作者向NOD/SCID小鼠静脉注射经寡霉素处理或控制的MDA-MB-231细胞，21 d后收集小鼠肺组织。流式细胞术分析显示，治疗组肺转移细胞的频率几乎降低了三倍，表明OXPHOS抑制减弱了MDA-MB-231细胞的转移能力。作者继续使用类似的方法来测试OXPHOS抑制4T1细胞转移的效果，值得注意的是，在早期注射寡霉素处理过的4T1 GFP细胞的动物肺转移细胞减少了7倍，提示OXPHOS对促进转移级联反应的早期事件很重要。 图三：氧化磷酸化是肺转移的关键 综上所述，作者建立了一种可靠的方法，通过单细胞RNA测序和乳腺癌患者衍生的异种移植模型来识别罕见转移细胞的全局转录组改变。通路分析显示，线粒体氧化磷酸化是微转移中上调的主要途径，而原发性肿瘤细胞中糖酵解酶水平较高。氧化磷酸化的药理学抑制显著减弱了肺转移性播散，这表明了氧化磷酸化在转移中的功能重要性，并突出了其作为一个治疗靶点的潜力，以防止乳腺癌患者的转移性扩散。 与TNBC转移性播种量相关的代谢转移模型。 原文链接 https:///10.1038/s41556-020-0477-0 参考文献 1. Bianchini, G., Balko, J. M., Mayer, I. A., Sanders, M. E. & Gianni, L. Triple-negative breast cancer: challenges and opportunities of a heterogeneous disease. Nat. Rev. Clin. Oncol. 13, 674–690 (2016). 2. Weigelt, B., Peterse, J. L. & van’t Veer, L. J. Breast cancer metastasis: markers and models. Nat. Rev. Cancer 5, 591–602 (2005). 3. Oskarsson, T., Batlle, E. & Massagué, J. Metastatic stem cells: sources, niches, and vital pathways. Cell Stem Cell 14, 306–321 (2014) 医药加科研专家咨询服务项目： 1.针对sci文章的课题实验设计服务 2. SCI文章发表评估服务 3. SCI文章修改服务（侧重实验设计，逻辑结构，统计分析） ，先评估再报价 4. 肿瘤领域高水平文章（10分以上），科研大咖一对一跟踪辅导直到发表（课题设计+文章整理） 5. 生物信息学数据挖掘与分析服务 6. 针对国自然基金的课题设计服务 7. 国自然标书预评审 8. 国自然标书专家一对一辅导修改 联系人：范老师 15301721511 |
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