抗SARS冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备和初步应用

SARS冠状病毒(SARS coron-a yir us， SARS-CoV) 的N蛋白(nucleocapsid protein) 是一种重要的结构蛋白， 位于病毒颗粒的核心部分与病毒RNA结合， 在病毒的包装等过程中起重要作用0.为此， 我们应用杂交瘤技术， 制备了抗SARS的N蛋白的单克隆抗体(mAb) ， 为研制ELEA检测试剂盒用于SARS-CoV的临床诊断及实验室研究提供了重要的制剂。

材料和方法

1.1 材料

谷胱甘肽巯基转移酶(GST) 融合蛋白纯化试剂盒， 购自Amersham Pharmacia Biotech公司。HAT购自Pro-mega公司。BALB/e小鼠购自军事医学科学院动物中心。骨髓瘤细胞株Sp 2/0为本室保存。DMEM培养基、胎牛血清为Gibco公司产品。羊抗鼠lgG-HRP购自华美生物工程公司。聚乙二醇(PEG， M， 4000) 、免疫球蛋白标准亚类抗血清购自Sigma公司。HBV、HEV诊断试剂盒购自北京科卫临床诊断公司。HCV多肽抗原由我室自制。重症SARS死亡病例肺组织石蜡切片由我院病理科制备。二步法免疫组化检测试剂(PV 6000) 购自Zymed公司。其他常规用试剂为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 GST-N的分离纯化

将表达GST-N蛋白的大肠杆菌经超声破碎， 离心取上清， 用GST融合蛋白纯化试剂盒纯化后， 进行120g/LSD S-PAGE鉴定。用空载体表达上清离心后， 经试剂盒纯化得到GST融合蛋白。

1.2.2免疫动物以纯化GST-N(50~100pg/次) 腹腔注射免疫8~12wk龄BALB/e小鼠， 共免疫4次。第1次和第2次间隔3wk，第2次和第3次间隔2wk，第4次免疫于融合前3d进行，剂量均同。第1次免疫加弗氏完全佐剂，其余3次均加弗氏不完全佐剂.

1.2.3 杂交瘤细胞株的建立

细胞融合、筛选、克隆化及腹水的制备均按常规方法进行[21.对细胞上清采用间接ELISA测得GST-N阳性而GST阴性的克隆采用有限稀释法， 进行3次克隆化。

1.2.4腹水mAb的纯化

采用饱和硫酸铵盐析法纯化腹水mAb。紫外分光光度计进行蛋白定量。

1.2.5 mAb的特异性鉴定

Ig亚类鉴定：将羊抗鼠lgG、IgG 1、IgG2a、IgG2b、IgG 3和IgM与浓缩10倍的杂交瘤细胞培养上清进行免疫双扩散，观察沉淀线的形成。效价及相对亲和力的测定：均采用间接ELISA法[.后者以被检mAb的不同浓度为横坐标，以其相应的4值为纵坐标绘出测定曲线，曲线上部趋于平坦段的A值为100%，以A值为50%点的mAh浓度表示mAb的相对亲和力。特异性鉴定：mAb与GST-N蛋白的结合活性采用Western blot法：将纯化的GST-N目标蛋白进行120g/LSD S-PAGE后， 再将凝胶蛋白带电转移至硝酸纤维素膜上[4， 依次与mAb及HRP-羊抗鼠IgG反应后以DAB显色。mAb与HBV、HEV及HCV抗原的交叉反应性检测， 采用间接ELEA.免疫组化检测：mAb与SARS病例肺组织石蜡切片反应采用二步法免疫组化：枸橼酸盐缓冲液抗原热修复， mAb(1； 1000稀释) 4过夜， 通用型二抗3720min， DAB显色， 期间每步均用PBS浸洗3次， 2min/次， 正常组织和不加mAb的SARS组织切片为阴性对照，其他步骤按常规操作。

 

结果

2.1人GST-N蛋白的纯化

在大肠杆菌表达的GST-N蛋白经超声破碎后， 取上清用GST融合蛋白纯化试剂进行纯化。纯化的GST-N蛋白经120g/LSD S-PAGE鉴定纯度达到电泳级(图1)。

2.2  杂交瘤细胞株的建立

以纯化GST-N免疫BALB/e小鼠，末次免疫后小鼠血清效价1x10-4，取其脾细胞进行常规细胞融合，融合率为42%。经3次有限稀释法克隆化得到1株能稳定分泌特异性mAb的杂交瘤细胞系， 命名为3E10H。纯化得到mAb浓度1.9g/L。

2.3mAb的鉴定 

Ig亚类鉴定：免疫双扩散检测该株mAb为IgG2b。效价测定：间接ELISA法检测腹水mAb效价为8x 10-5.相对亲和力的测定：采用间接ELISA法测得mAb的相对亲和力为1.725x 10-l mol/L。特异性鉴定： Western blot鉴定表明， mAb可识别M， 为74x 10°的条带， 而与宿主菌BL2I(DE 3) 的裂解物、空质粒PGEX-2T裂解物均无交叉反应(图2) 。间接ELISA法：HBSAg和HCV多肽抗原及HEV抗原与纯化的mAb均无结合反应。免疫组化：mAb在SARS病例的肺组织切片中检测出阳性颗粒， 与原位杂交报道相符[S 1.肺组织中SARS-CoV阳性颗粒多位于巨嗜细胞和少量的肺泡上皮细胞胞质着色(图3)，对照均未出现阳性颗粒。

讨论

SARS-N蛋白是由SARS-CoV编码的核衣壳蛋白， 其M，为40x10°~45x10'。N蛋白位于病毒的核心部位，与病毒基因组RNA结合。对鼠肝炎病毒的研究表明， N蛋白可识别病毒基因组RNA特征性序列， 并可与其他结构蛋白相互作用，对于病毒粒子的准确组装具有重要意义.

本研究中， 我们用原核表达系统表达的高纯度的GST-N蛋白免疫BALB/e小鼠， 建立了1株能稳定分泌抗SARS-N蛋白mAb的杂交瘤细胞3E10H。其分泌的mAb3E10H亲和性好、特异性高， 为SARS-CoV的进一步研究， 特别是对SARS-CoV N蛋白的研究， 提供了重要的试剂。

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