SARS冠状病毒S蛋白的功能性受体2ACE2

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病毒膜糖蛋白通过结合细胞表面受体开始侵入细胞,接着发生构象改变导致膜融合并且将基因释放入细胞质。冠状病毒的S糖蛋白在病毒包膜上形成特征性的冠状棘突,通过膜融合介导病毒与宿主细胞的融合,与细胞受体介导的感染有关[1],而且它介导融合的活性不需要其它病毒蛋白参与[2],因此它是研制中和抗体的主要靶目标。最近的研究表明ACE2是SARS2CoVS蛋白的功能性受体。

1血管紧张素转化酶2(ACE2)2SA2RS冠状病毒S蛋白的功能性受体

许多带有不同的序列、结构和细胞功能的细胞表面相关的分子被病毒霸占而作为它们的受体。受体鉴别对理解病毒嗜性、致病性和入侵机制等方面是很重要的,并且可以在治疗和疫苗的发展方面有所帮助。目前人们已经鉴定出2种冠状病毒的表面受体:II型冠状病毒—小鼠冠状病毒(MHV)的受体是鼠癌胚抗原相关细胞黏附分子(CEACAMs)—受体免疫球蛋白超家族成员;许多I型冠状病毒,例如人冠状病毒229E、传染性胃肠炎病毒和猫传染性腹膜炎病毒则需要锌金属蛋白酶氨肽酶N(APN,CD13)作为受体以进入它们的靶细胞。

SARS2CoV基因组的分析说明这种病毒不属于已知的3种冠状病毒[3,4],SARS2CoVS糖蛋白的氨基酸序列和其它冠状病毒的S糖蛋白序列之间,除了一些在S2亚基上的保守序列外,其它序列相似性水平很低(同源性为20%～27%),说明它们功能和结构亦不同。某些冠状病毒的S蛋白(如鼠肝炎病毒MHV和传染性支气管炎病毒)可以分为2部分(S1和S2)[6];其它冠状病毒(I型和SARS2CoV)的S蛋白,不能被分开[3,4]。但是,后者的S1和S2区域可以通过与那些能分裂的冠状病毒S蛋白的S1和S2亚单位的同源性来鉴别。冠状病毒的S1区域介导了它们与受体的原发高亲和力的结合[7,8]。

Li等[9]鉴定了一个金属肽酶,即从SARS冠状病毒易感的非洲绿猴肾细胞株VeroE6细胞分离出来的血管紧张素转化酶2(ACE2)[10,11],可以有效地结合SARS2CoV的S蛋白的S1区域。ACE2的可溶性形式能够阻滞S1区域与VeroE6细胞的联系。用受体ACE2转染的293T细胞可与表达S蛋白的细胞形成多核合胞体。SARS2CoV能够在ACE22转染的293T细胞中有效地复制,而抗2ACE2的抗体阻滞病毒在VeroE6细胞的复制。这些数据说明ACE2是一个SARS2CoV的功能性受体,具有作为SARS2CoV棘突糖蛋白介导病毒入侵和细胞融合的参与者的功能。

1.1SARS2CoVS蛋白的S1区域和ACE2间高度亲和力的结合

非洲绿猴肾细胞株VeroE6中可以有SARS2CoV的复制[12]。他们第一次研究了是否SARS2CoVS蛋白的S1区域可以与VeroE6细胞结合。采用共免疫沉淀法:将VeroE6细胞的溶胞产物与病毒S1糖蛋白共免疫沉淀,得到1个接近110ku的蛋白条带。用胰蛋白酶消化法和质量光谱测定法分析110ku条带,鉴定出1个氨基酸片段,与人ACE2的氨基酸序列的17%相符合。因为ACE2的组织分布和亚细胞定位都适合作为SARS2CoV受体[10,19],他们将从人肺中得到的ACE2进行了全DNA克隆以进行更进一步的分析。用ACE2质粒转染的293T细胞可以被S12Ig特异性的识别,ACE2的溶解形式可以阻滞S12Ig与VeroE6细胞的结合。另外,S12Ig免疫沉淀了可溶的ACE2后,能够被抗2ACE2的抗体识别。这些数据证明了在SARS2CoVS蛋白的S1区域和ACE2之间存在一个特异性的高度亲和力的结合。

1. 2依赖于ACE2的SARS2CoVS蛋白介导的细胞2细胞融合

在病毒和细胞膜间介导融合的蛋白质可能在某些情况下也介导表达病毒融合蛋白的细胞和相应的病毒受体间的融合。例如,表达HIV21包膜蛋白gp160的细胞可以与表达HIV21受体CD4和CCR5的细胞形成多核合胞体。因为已经在培养的感染了SARS2CoV的VeroE6细胞中、在SARS2CoV感染的灵长类动物身上及在SARS患者身上观察到了合胞体[12,16,17],他们研究了是否表达SARS2CoVS蛋白的293T细胞可以与表达ACE2的293T细胞融合。正如人们期望的,用CD4和CCR5转染的293T细胞与表达HIV21gp160的细胞形成了许多合胞体,但是不与表达SARS2CoVS蛋白的细胞结合。相反,表达ACE2的293T细胞不与表达gp160的细胞形成合胞体,但是与表达S蛋白的细胞形成许多大的合胞体。293T细胞表达的S蛋白也有效地与ACE22但不与对照物转染的HeLa细胞形成合胞体。加入纯化了的ACE2抗体后,超过95%的S蛋白和ACE22表达的细胞之间合胞体的形成被阻滞,但是不被对照抗体阻滞。这些数据证明SARS2CoVS蛋白介导细胞2细胞融合的能力是依赖于ACE2的存在的。

1. 3ACE2介导的病毒复制

Li等还研究了ACE2介导病毒复制的能力。ACE2和对照物转染的293T细胞在存在或不存在SARS2CoV的情况下孵化。2d后,在ACE2转染的含有SARS2CoV的293T细胞的培养基中,可以观察到大量分离的、圆形漂浮的细胞,与病毒复制相符。相反,对照物转染的含有SARS2CoV的293T细胞和没有加入SARS2CoV的对照细胞没有出现上述细胞病理现象。用RT2PCR法测量细胞上清液中的病毒基因组RNA,发现在ACE22转化的细胞的上清液中,病毒基因复制物在最初的48h增加了100000多倍。相反,在对照物转染的细胞的上清液中,病毒基因复制物在相同时间内仅增加了10倍。另外,用滴定法测量了ACE2转染的和对照物转染的细胞上清液中的病毒滴度,ACE22转染的细胞上清液在96h后得到了病毒株,一直到伴有明显的细胞病变效应(CPE),并且达到最高稀释度滴定值(1∶6561),然而从对照物—转化的细胞获得的病毒株在超过1∶27稀释度时仍没有诱导出CPE,与上述2个感染评价中观察到的基本一致。而且抗2ACE2抗体以一种剂量依赖的方式抑制了细胞病变。总之,这些数据显示ACE2有利于从实质上促进SARS2CoV的复制。

对72个人类组织的实时PCR分析已经证实在支气管、肺实质及心脏、肾和胃肠道中有ACE2信使RNA的有效表达[11]。这一组织分布与SARS的病理变化一致:以肺的急性感染为特征[12,18,16]。在感染的患者的肾组织中也发现了SARS2CoV[12],并且可以在灵长类动物的肾细胞株FRhK24和VeroE6中有效地复制[12,16]。在小肠和大肠中也观察到了有效的病毒复制[21]。排泄物中的病毒的检测可以反应这些组织中ACE2表达的信息[19]。

1.4ACE2与S蛋白相互作用介导的膜融合过程的关键特征

首先,由于ACE2和S的重组体的表达导致了pH为中性时的细胞融合,说明融合不需要低pH和其它病毒蛋白。然而仍有可能低pH对游离病毒颗粒的摄取是很重要的。其次,S糖蛋白不能被分裂成任何可以测量的片段,但是不能排除在融合过程中可能存在的细胞表面蛋白酶的分裂作用。最近,生物化学和功能的数据显示冠状病毒S糖蛋白是I类融合蛋白[20],不能分裂使得SARS2CoVS糖蛋白与其它冠状病毒及普通的可以分裂的I型融合蛋白区分开。最后,通过在合胞体形成基础上的融合实验,说明可以利用ACE2与S蛋白相互作用介导的膜融合过程,在不需要使用致命的病毒的基础上研究SARS2CoV的致病机制和进行抑制剂检测。

1.5ACE2与S蛋白相互作用的分子机制的原始线索

ACE2催化部位的2个变异(2个活性位点组氨酸被修饰成天冬氨酸),不影响合胞体的形成,说明在ACE2上的S结合位点是位于不同的区域的,并且ACE2的酶功能对融合来说是不需要的。ACE22S1复合体能够耐受免疫共沉淀过程,也说明它是一个高亲和力的相互作用。对绝大多数病毒2受体相互作用来说(但不是全部),高亲和力结合说明存在受体诱导的病毒蛋白构象变化的可能。是否SARS2CoV糖蛋白将遵循这一规律还需要观察。

1. 6ACE2作为SARS2CoV受体的结构和功能

模型ACE2是金属蛋白酶ACE同系物中的一员[15,11],ACE有2个亚型:躯体性ACE(sACE)和睾丸2特异性ACE(tACE)。因为只有靶蛋白与已知三维结构模板的序列同一性超过30%,方可用来估计靶蛋白的精确结构,而ACE2与tACE和ACE果蝇属同系物(AnCE)之间有高度的序列相似性(分别是:序列同一性为43%和35%,相似性为61%和55%)。最近,tACE[23]和果蝇属ACE同系物AnCE[14]的晶体结构已经分别鉴定出来,因此以这些晶体结构作为模板,通过计算机对比同系物模型,来构建ACE2的三维立体模型成为可能。

1. 6.1ACE2模型人类ACE2酶的细胞外区域由2个亚基组成:首先是锌金属肽酶区域(残基192611),其与人类躯体和睾丸ACE相应的区域有42%的同一性[15]。第二个区域位于C2羧基端(残基6122740)。ACE2分子顶端的金属肽酶区域可以进一步分成2个亚域(I和II)[15],形成一个长而深的沟(40!长×15!宽×25!深),其两边包含催化位点[5]。这个沟被包含多环、单环环绕四周的β2折叠构成的隆起线所环绕,这2个催化亚域只在活性位点的底部连接在一起。一个显性α2螺旋(螺旋20;残基5142533)连接这2个亚域并且形成裂缝底部的一部分。ACE2深陷而分离的蛋白水解酶活性位点符合一个蛋白酶的基本结构特征,用以避免功能性蛋白酶的水解作用。亚域I位于N2末端,亚域II位于C2末端[15]。

1.6.2ACE2结构模型的意义ACE2顶端的深沟表面和周围的隆起线带有很高的负电荷[5],这些隆起线包括残基D136,E150,N154,D157,D292,D295和D299,这些残基导致了S2糖蛋白与ACE2的特异性结合。疏水性分析显示在靠近负电荷隆起线上有特殊的疏水斑,可能也对S2糖蛋白与ACE2的结合起促进作用。ACE2的结构模型证明这些环绕裂缝顶端的隆起线可能作为与S2糖蛋白结合区域(图1),原因如下:首先,分子的顶端是远离膜的,并且比膜近侧区更容易结合。其次,突出的结构可能用于被病毒蛋白结合,也保证了与病毒几何结构上凹面的互补。第三,隆起线所带的负电荷与S2糖蛋白RBD的正电荷互补。第四,围绕电荷的疏水斑可能促进结合。最后,分子顶端缺乏碳水化合物的特点更能保证高亲和力的结合。

 

1. 6.3ACE2的大绞链2弯曲运动PaulTowler等[15]将天然ACE2和抑制剂2结合形式的ACE2的晶体结构分别鉴定到了2.2,3.0!分辨率。通过这些结构的对比显示了一个大的抑制剂依赖的亚域I向亚域II的～16°亚域绞链弯曲运动,在此过程中亚域II基本保持不变,亚域I移动以接近这个裂缝,大体上模仿一个蛤壳关闭的动作,这种运动带领重要残基进入催化位置。

1.6.4ACE2介导的肽水解作用的催化机理ACE2的催化机理,与其它的HEXXH锌金属肽酶异种集团成员的机制有许多共同的特征[22]:原始的ES复合物形成和四面体中间物生成。这个ES复合物的形成导致了一个亚域I向亚域II的～16°亚域绞链弯曲运动,带领所有催化元素进入同一个功能方向。这些底物和抑制剂依赖的亚域运动与诱导契合和催化的过渡态理论一致。1.6.5人类ACE2功能区与鼠、兔ACE2蛋白质序列比对经蛋白质库BLAST检索,将人类ACE2功能区氨基酸(即ACE2顶端深沟的表面和周围的隆起线上的残基D136,E150,N154,D157,D292,D295和D299)与鼠、兔ACE2蛋白质序列进行比对,结果发现鼠的ACE2与人类比较相近,而兔的ACE2结构则相差较远(图2)。鼠和兔的ACE2能否与SARS2CoVS蛋白结合目前尚没有研究证实,可能转人类ACE2基因的鼠可以作为研究SARS的动物模型。

 

2SARSS蛋白有效的ACE2结合位点的鉴定

2. 1S蛋白的受体2结合区域(RBD)的估计为定位S糖蛋白的受体2结合区域(RBD),Xiao等[2]应用了一种以不同的可溶性片段与ACE2受体表达的VeroE6细胞结合为基础的检测方法。他们在表达型载体中克隆了DNAs编码的全长S蛋白(1255个氨基酸)[4];外功能区Se(S1721189,删除了假定的跨膜区和胞质尾区);N2末端的276个,537个和756个氨基酸残基片段(分别是S276,S537和S756);一个内部的S2722537片段(图3)。结果除了最小的片段(S276)外的所有可溶性S蛋白片段均与VeroE6细胞结合,结合与片段的表达水平是一致的,与它们的大小近似成反比。这些分析说明RBD位于残基272和537之间。为进一步定位RBD,他们应用了抗体(IMG542),用一个包含S2882303的肽链引出。尽管这个抗体确实结合S537片段,但它不抑制这个片段与VeroE6细胞的结合,说明RBD是位于残基303和537之间。这里描述的直接的细胞结合途径可能对其它病毒受体的鉴别也是有帮助的。

2SARSS蛋白有效的ACE2结合位点:S3182510SweeKeeWong等[13]为鉴别S蛋白的受体结合部位,从这种融合蛋白S12Ig的S1亚基上的N2和C2末端连续删除基因片段产生了12种变异体(图4)。

 

用S12Ig和它的变异体来沉淀代谢标记的可溶形式的ACE2。S122327及S122481不与ACE2结合。而S122510和S122572可以有效地结合ACE2。这些数据说明S1亚基的C末端上的S5112672对与ACE2的结合没有很大的作用。从S12IgN末端上橇除S122260对ACE2的结合没有影响。变异体S2982510和S3182510有效地结合ACE2。S3182510变异体比全长的S1亚基沉淀ACE2更加有效。然而,2个非常微小S1亚基的片段(S3182490和S3272510)不能沉淀ACE2。这些数据暗示残基从S3182326和从S4912509或者直接对S1亚基与ACE2的结合起作用或者对受体结合区域的折叠的校正起作用。

S12Ig变异体(包含S3182510)与全长S12Ig与ACE2结合的亲和力检测显示,同样浓度(50nmol/L)的S3182510沉淀比S12Ig要多2倍,而浓度为25nmol/L的S3182510与50nmol/LS12Ig沉淀相同数量的可溶性ACE2,说明S3182510的变异体结合ACE2的效率的至少是S12Ig的2倍。

应用一个有慢病毒表达的绿色荧光蛋白和SARS2CoVS蛋白的假模系统转染稳定地表达ACE2的293T细胞,以检测S12Ig和S3182510变异体阻滞S蛋白介导的感染的能力。结果显示将293T细胞与S122327变异体一同孵化对感染没有影响,与这种变异体没有与ACE2结合的能力一致。S12Ig的半抑制浓度接近50nmol/L,而S3182510变异体的半抑制浓度为小于10nmol/L。用荧光显微镜观察S3182510的视野,观察不到绿色细胞。

为鉴别是否在S3182510和S3272510变异体与ACE2结合的能力间的差异是由于后者的变异体中缺乏半胱氨酸的结果,SweeKeeWong等作了一系列的点突变,把在S3182510内的7个半胱氨酸的任何一个都用丙氨酸代替。含有半胱氨酸323的变异体与S3182510自身以同样的效率结合ACE2。半胱氨酸378的改变对结合的作用也比较小;然而,残基323和378的突变的复合体导致了与ACE2结合能力降低。半胱氨酸366,419,348,467和474的改变阻止了ACE2的有效沉淀。这些数据表明除在S3182326之间的决定子半胱氨酸323外,其余的直接或间接对与ACE2结合起到作用。并且说明这7个半胱氨酸中的绝大多数对与ACE2结合有促进作用,最后,SweeKeeWong等研究了在S3182510之间的一些氨基酸残基(分别是E452A,D454A,D463A和D480A,即谷氨酸452、门冬氨酸454,463和丙氨酸480),促进ACE2结合的功能。D480A突变没有影响与ACE2的结合。E452A和D454A突变的3182510变异体分别沉淀了S3182510变异体沉淀的ACE2的1%和10%,说明它们在S12蛋白与ACE2的相互作用中扮演重要角色。当E452突变时,全长的S1亚基,与3182510变异体以相同效率沉淀ACE2。D454A的改变完全终止了ACE2与S3182510变异体和全长S1亚基的结合。这些数据表明ACE2与SARS2CoVS1在亚基门冬氨酸454附近相互作用。

研究显示在S3182510之间集中了SARS2CoVS蛋白受体结合区域:由193个氨基酸(S3182510)组成,其比全长的S1亚基更有效地结合ACE2,并且比S1蛋白具有更好的可溶性或更好的折叠性。由于它比全长S1亚基有与ACE2更大的亲和力,S3182510受体结合区域也能够比全长的S1亚基更加有效的阻滞S蛋白介导的与ACE2表达的细胞的结合。这一片段的进一步研究将为阻滞SARS2CoV的感染治疗的发展提供线索。

3应用前景

ACE2作为SARS2CoV受体的鉴定将有利于S蛋白受体结合区域的鉴定及推测S1蛋白基础上亚单位疫苗最有效的模板抗原表位。多价体sACE2免疫球蛋白可能是比sACE2更加有效的体内SARS2CoV感染的抑制剂。ACE2受体及其与S1片段结合的复合物的晶体结构的解决将使人们进一步了解它与病毒蛋白结合的机理。S糖蛋白的有效的受体结合位点有作为疫苗免疫源引出中和抗体的潜在可能。最后,研究SARS2CoVS蛋白与其它动物的ACE2之间的相互作用将提供对这种病毒起源的认识。这样,如果SARS再次危害人类健康的话,这些研究将对这种疾病的控制发挥作用。