|
大神一句话，菜鸟跑半年。我不是大神，但我可以缩短你走弯路的半年~ 就像歌儿唱的那样，如果你不知道该往哪儿走，就留在这学点生信好不好~ 这里有豆豆和花花的学习历程，从新手到进阶，生信路上有你有我！
ChIP-seq的目的是研究感兴趣蛋白在基因组上的结合位点，可以用来鉴定转录因子（transcription factor, TF）的结合位点或者转录后更广范围的组蛋白修饰（histone marks），一般与调控元件有关。 高通量测序（high-throughput sequencing ,HTS）2005年首次提出，平台包含了：二代测序Illumina/Solexa, Roche/454, SOLiD (ABI), Ion Torrent以及三代测序Pacbio（曾打算被illumina以12亿美元收购，但未成功）, Oxford Nanopore。这里主要讨论illumina产出的数据（毕竟现在市场份额最大，2018年达到83.9%），其他平台也是类似，只不过在文库制备、测序的步骤有差别。 染色质免疫沉淀（Chromatin immunoprecipitation ，ChIP）技术诞生很早，由Orlando等人创立于1997年，发表于2000年，先利用Microarray技术 ChIP-chip，后2007年利用DNA sequencing技术 ChIP-seq。
染色质准备整个流程从福尔马林对染色质上的蛋白与DNA交联开始
这样就相当于拍了个照片，把基因组上分布的蛋白质和各种修饰定格下来 然后，把交联的染色质进行超声裂解，一般破碎后的片段大小为200bp左右 note：以上是采用交联的ChIP-seq（X-ChIP），如果是N-ChIP则采用微球菌核酸酶裂解染色质以获取DNA片段（一般会得到147bp左右的片段），这种方案一般用于组蛋白修饰；但对于其他转录因子的研究，如果交联方法使得抗原表位（就是抗原决定部位）被掩，不能被抗体识别，那么也可以使用N-ChIP去做；但真心不推荐使用N-ChIP去做转录因子的研究，因为它们和染色质的结合比较松散，而N-ChIP的方法可能会破坏这本来就松散的联系，丢失很多相关的DNA
免疫沉淀接下来，与蛋白特异性结合的 或者 与感兴趣的修饰部位特异结合的 抗体就出动了。用来识别蛋白-DNA复合物并带它们出来（俗称“拉下来”）。而这些抗体本身是带有“标签”的（可以想象成：抗体一个头有一个磁铁N极，待他把蛋白-DNA复合物结合，完成任务后，总部使用另外的磁铁S极把这个抗体连同复合物一起救走）【术语是：be pulled down and enriched using beads binding to the antibody】 救回来以后，要进行清洗（去掉那些没有特异性结合的），蛋白又被消化掉，剩下的DNA被收集纯化起来，准备建库和测序 建库一般需要修补DNA的两端、加上接头，另外如果测序仪的一条lane需要测不同的样本，那么还需要为DNA加上用于区分样本的index 接头（方便测序结束后将reads归类） 该加的都加好后，进行纯化和PCR扩增（保证测序上机浓度）。而扩增这里就是众所周知的引入偏差的一环，在保证上机浓度前提下，PCR扩增的循环数应该限制到越小越好。之后建好的文库，就要加载到测序仪的玻璃载片（术语：flow cell，和显微镜的玻璃载片很像）进行测序 测序对DNA片段测序都是从5’测到3‘，接头也分正反（forward and reverse两种类型），它们也是随机连接到双链DNA片段上的； 单端测序：可以从forward或者reverse任一个接头一端开始 双端测序：从forward和reverse接头同时开始 产生的测序读长（read，测序就像读书一样一字一句，所以产出的数据是名词read，翻译为读长）一般比文库制备的DNA片段要短（从两边向中间测，不过也不排除有测通的情况） 总结A图就是实验步骤；B图是之后会介绍的数据处理步骤 |
|
|
