银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法（专利）

专利名称：一种银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法 技术领域： 本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法。 背景技术： 银杏属银杏科裸子植物，又叫白果树、公孙树，是我国特有的珍贵树种，也是世界上最古老的树种，被称做“活化石”，在我国有着广泛的分布。银杏在我国作为药用已有5000多年的历史，现代医学研究发现银杏叶具有降血脂、清除氧自由基、增强神经系统功能、调节急速水平、抗炎抗过敏等作用，近年来，银杏叶用作保健食品和植物药，广泛用于防治记忆力下降、痴呆及心脑血管疾病。银杏叶的化学成分较为复杂，其主要有效成分为黄酮和内酯两类。到目前为止，国内外关于银杏叶及其制剂的质量监控方法主要是测定黄酮醇苷和内酯含量，国际标准要求银杏制剂中的银杏黄酮含量大于24%，银杏内酯含量大于6%。关于银杏叶及其制剂中黄酮含量的测定方法，目前都是在水解的基础上，以槲皮素、山奈酚、异鼠李素三种黄酮苷元为对照，利用HPLC方法测定三种苷元的量，再乘以系数2.51计算得到的。这一系数是根据银杏叶总黄酮苷中认为活性强的香豆酰基黄酮醇苷的平均分子量760与苷元的分子量进行换算，是 建立在假设银杏叶中所有的黄酮醇苷分子量都是760的基础上，而实际上它只占银杏黄酮的一小部分。为了达到银杏黄酮24%的含量，个别银杏叶提取物会有人为添加芦丁的现象。同时，利用水解的方法测定银杏黄酮的含量，水解时间长，耗时费力，并且水解的条件如盐酸的浓度与加热时间会影响水解的程度，可能会出现水解不完全或水解过度，影响测定结果。为了提高银杏叶及其制剂的质量，同时能够充分体现银杏叶中黄酮醇苷的真实含量与成分，从而达到在生产和制剂过程中质量均一性，需要发展一种银杏叶提取制备方法，将银杏黄酮有效组分制备出来，明确成分，不需要水解便能直接测得它的真实含量，以此为指标，监测生产中每一步银杏黄酮的含量，可以提高产品的质量及稳定性。  发明内容 针对上述缺陷，本发明提供一种能够将银杏黄酮有效组分制备出来，明确成分，不需要水解便能直接测得它的真实含量，并且提高产品的质量及稳定性的银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法。为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是:一种银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法，其特征在于:步骤如下:1)、提取:称取含水量为1%_10%的银杏叶，加入其重量8-12倍，浓度为10%_50%乙醇，20-50°C浸泡提取2-5次，每次1-5天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.15-1.25 的浸膏； 2)、醇沉:将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70%，并充分搅拌，0-4°C冷藏静置12-36小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.10-1.25的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到70-90%，并充分搅拌，0-4°C冷藏静置12-48小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.15-1.25的浸膏；3)、水沉:将醇沉完的浸膏中按照1:5-1:10的体积比加入水，充分搅拌，0-4°C冷藏静置24-240小时，过滤，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.05-1.10的浸膏；4)、大孔树脂分离:将水沉完的浸膏上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1:5-1:50，分别采用不同体积浓度的乙醇水溶液作为洗脱液，分别采用水、体积浓度10-30%乙醇、体积浓度30-60%乙醇和60-90%乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3_6个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；收集10-30%乙醇和60-90%乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.10-1.20的浸膏；5)、新型硅胶基质键合材料的二维液相色谱制备:以粒径10-100微米的新型硅胶基质键合材料为填料，以不同体积浓度的甲醇水溶液作为洗脱液，收集目标洗脱组分为一维组分，再以粒径为5-80微米的新型硅胶基质键合材料为填料，以不同体积浓度的甲醇水溶液作为洗脱液，收集目标洗脱组分为二维组分，干燥处理即为银杏黄酮组分化合物。进一步地说:所述步骤3)中，提取物水沉工艺结束后，先通过转速为10000-25000转/分钟的高速离心机离心，再进行大孔树脂分离。更进一步地说:所述步骤4)中，大孔树脂的型号为非极性聚苯乙烯型，大孔树脂分离洗脱时，其目标组分采用体积浓度为10 -30%乙醇和60-90%乙醇溶液洗脱，并将两种洗脱液合并浓缩。更进一步地说:所述步骤5)中，一维制备采用的洗脱液为不同体积浓度的甲醇水溶液，甲醇的体积浓度变化范围为15-60%，二维制备采用的洗脱液为不同体积浓度的甲醇水溶液，甲醇的体积浓度变化范围为10-50%。更进一步地说:所述制备得到的银杏叶黄酮组分为山奈酚-3-0-2”，6”_ 二鼠李糖基葡萄糖苷，芦丁，槲皮素葡萄糖基鼠李糖苷，山奈酚-3-0-芸香糖苷，异鼠李素-3-0-芸香糖苷，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷以及山奈酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷，其总含量占银杏叶质量的1.0-3.5%，得到的银杏黄酮组分纯度在70%以上，其中山奈酚-3-0-2”，6”- 二鼠李糖基葡萄糖苷占7-11%，芦丁占8-12%，槲皮素葡萄糖基鼠李糖苷占12-16%，山奈酚-3-0-芸香糖苷占13-15%，异鼠李素-3-0-芸香糖苷占15-18%，，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷占9-11%，山奈酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷占6-9%。 由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明与现有技术相比具有以下特 占- ^ \\\. 1.银杏黄酮组分的含量高，成分和含量明确。由于本发明针对目标化合物的结构特点，设计了系统的提取分离制备工艺流程，并使用了大孔树脂和新型硅胶基键合材料，通过二维液相色谱分离制备，得到银杏黄酮组分纯度在70%以上，银杏黄酮组分中各银杏黄酮的成分和含量明确，可作为舒血宁注射原料。2.重现性好:本发明利用提取分离工艺的标准化，特别是大孔树脂柱层析分离的标准化，以及新型硅胶基质键合材料化学性能的稳定性，可以保证分离制备的重现性和稳定性。3.方法简单易行，操作简便。本发明使用的仪器自动化程度高，操作方便、简单，常温常压下就可进行，适合大规模生产的需要。4.有机残留低。由于本发明摒弃了传统工艺中溶剂萃取、硅胶柱层析等工艺，采用了有机溶剂使用量较少的大孔树脂分离和新型分离材料，而且最终产品采用干燥处理，所以最终产品的有机溶剂残留特别小。5.药材来源广，易获得，价格便宜:银杏是我国特有的珍贵树种，占全世界资源的70%，银杏叶的总产量每年在2 X 107kg以上，资源极大丰富。三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂作为应用时间久、疗效明确、使用安全的中药注射剂，有着广泛的应用，而本发明制得的银杏黄酮组分是三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂中一种重要的原料。而本发明提供的制备方法，过程重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求，可用于舒血宁注射液、银杏叶酊剂原料银杏黄酮组分的制备。 具体实施例方式实施例:下面结合实例，对本发明做进一步说明。实例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。 实施例1:将含水量为6%的银杏叶原药材粉碎，定量称取10千克，置于200L提取罐加入重量100千克40%乙醇溶液，30°C浸泡提取3次，每次2天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.21的浸膏3.6L。将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到60%，并搅拌30分钟，4°C冷藏静置24小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.15的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到80%，并充分搅拌30分钟，4°C冷藏静置48小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.17的浸膏2.8L。将醇沉完的浸膏中按照1:6的体积比加入水16.8L，充分搅拌30分钟，4°C冷藏静置72小时，过滤，样品溶液经过20000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.07的浸膏2.5L. 将水沉完的浸膏上样于XAD-4型非极性大孔树脂柱，大孔树脂分离材料体积为25L,分别采用150L水、120L体积浓度20%乙醇、90L体积浓度50%乙醇和90L 80%乙醇洗脱，流速为2个柱体积/小时；收集20%乙醇和80%乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.10的浸膏1.1L ；称取粒径40微米的新型娃胶基质键合材料3千克,装柱,柱径100mm,柱长380mm,分别用10L15%甲醇水溶液、16L55%甲醇水溶液洗脱，收集55%洗脱组分，加热浓缩为一维组分，称取粒径30微米的新型娃胶基质键合材料3千克,装柱,柱径80mm,柱长300mm,分别用10L10%甲醇水溶液、20L30%甲醇水溶液洗脱，收集30%洗脱组分，加热浓缩，真空干燥处理即为7种银杏叶黄酮组分120克，纯度为90%，约占银杏叶质量的1.2%。银杏黄酮组分含量分别山奈酚-3-0-2”，6”-二鼠李糖基葡萄糖苷12g，占组分的10%，芦丁 14.4g，占组分的12%，槲皮素葡萄糖基鼠李糖苷18g，占组分的15%，山奈酚-3-0-芸香糖苷占18g，占组分的15%，异鼠李素-3-0-芸香糖苷21.6g，占组分的18%，，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷 13.2g，占组分的11%，山奈酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷10.Sg,占组分的9%。可制成舒血宁注射液25000支。实施例2:将含水量为2%的银杏叶原药材粉碎，定量称取2千克，置于50L提取罐加入重量18千克20%乙醇溶液，45°C浸泡提取5次，每次I天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.15的浸膏1.1L。将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50%，并搅拌30分钟，4°C冷藏静置36小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.12的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到85%，并充分搅拌30分钟，4°C冷藏静置24小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.24的浸膏0.7L。将醇沉完的浸膏中按照1:10的体积比加入水7L，充分搅拌30分钟，4°C冷藏静置240小时，过滤，样品溶液经过25000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.09 的浸膏 0.35L。  将水沉完的浸膏上样于XAD-1600型非极性大孔树脂柱，大孔树脂分离材料体积为15L，分别采用60L水、50L体积浓度30%乙醇、60L体积浓度40%乙醇和80L 75%乙醇洗脱，流速为1.6个柱体积/小时；收集30%乙醇和75%乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.08的浸膏0.23L ；称取粒径10微米的新型硅胶基质键合材料0.7千克，装柱，柱径70mm，柱长210mm，分别用3.5L12%甲醇水溶液、4L25%甲醇水溶液洗脱，收集25%洗脱组分，加热浓缩得到一维组分，称取粒径5微米的新型娃胶基质键合材料I千克，装柱，柱径100mm,柱长250mm,分别用3.5L12%甲醇水溶液、4L50%甲醇水溶液洗脱，收集50%洗脱组分，真空干燥处理即为7种银杏叶黄酮组分，得到的银杏黄酮组分31克，纯度为92%，约占银杏叶质量的1.55%。银杏黄酮组分含量分别山奈酚-3-0-2”，6”-二鼠李糖基葡萄糖苷3.4g，占组分的11%，芦丁 3.72g，占组分的12%，槲皮素葡萄糖基鼠李糖苷4.96g，占组分的16%，山奈酚-3-0-芸香糖苷占4.65g，占组分的15%，异鼠李素-3-0-芸香糖苷5.58g，占组分的18%，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷3.41g，占组分的11%，山奈酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷2.79g，占组分的9%。可制成舒血宁注射液6500支。实施例3:将含水量为9%的银杏叶原药材粉碎，定量称取25千克，置于500L提取罐加入重量300千克50%乙醇溶液，50°C浸泡提取2次，每次5天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.23的浸膏7.9L。将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到70%，并搅拌30分钟，4°C冷藏静置15小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.14的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到85%，并充分搅拌30分钟，4°C冷藏静置40小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.19的浸膏4.6L。将醇沉完的浸膏中按照1:8的体积比加入水36.8L，充分搅拌30分钟，4°C冷藏静置120小时，过滤，样品溶液经过20000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.06的浸膏7.4L。将水沉完的浸膏上样于X-5型非极性大孔树脂柱，大孔树脂分离材料体积为200L,分别采用1000L水、700L体积浓度25%乙醇、1100L体积浓度40%乙醇和600L 90%乙醇洗脱，流速为2个柱体积/小时；收集25%乙醇和90%乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.12的浸膏3.3L ；称取粒径100微米的新型硅胶基质键合材料9千克，装柱，柱径200mm，柱长295mm，分别用30L16%甲醇水溶液、20L60%甲醇水溶液洗脱，收集60%洗脱组分，加热浓缩为一维组分。称取粒径80微米的新型硅胶基质键合材料10千克，装柱，柱径250mm，柱长300mm,分别用20L20%甲醇水溶液、25L50%甲醇水溶液洗脱，收集50%洗脱组分，真空干燥处理即为7种银杏叶黄酮组分，得到的银杏黄酮组分400克，纯度为80%，约占银杏叶质量的1.6%。银杏黄酮组分含量分别山奈酚-3-0-2”，6”- 二鼠李糖基葡萄糖苷32g，占组分的8%，芦丁 40g，占组分的10%，槲皮素葡萄糖基鼠李糖苷52g，占组分的13%，山奈酚-3-0-芸香糖苷占56g，占组分的14%，异鼠李素-3-0-芸香糖苷64g，占组分的16%，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷40g， 占组分的10%，山奈酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷36g，占组分的9%。可制成舒血宁注射液76000支。实施例4:将含水量为8%的银杏叶原药材粉碎，定量称取5千克，置于100L提取罐加入重量60千克30%乙醇溶液，30°C浸泡提取4次，每次5天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为1.17的浸膏2.3L。将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到60%，并搅拌30分钟，4°C冷藏静置48小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.18的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到80%，并充分搅拌30分钟，4°C冷藏静置24小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.16的浸骨1.51L。将醇沉完的浸膏中按照1:9的体积比加入水13.6L，充分搅拌30分钟，4°C冷藏静置72小时，过滤，样品溶液经过15000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.09的浸膏1.4L。将水沉完的浸膏上样于HP-20型非极性大孔树脂柱，大孔树脂分离材料体积为50L,分别采用300L水、250L体积浓度15%乙醇、200L体积浓度55%乙醇和250L 75%乙醇洗脱,流速为I个柱体积/小时；收集15%乙醇和75%乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.11的浸膏0.57L ；称取粒径50微米的新型硅胶基质键合材料1.6千克，装柱，柱径100mm，柱长205mm,分别用6L14%甲醇水溶液、10L55%甲醇水溶液洗脱，收集55%洗脱组分，加热浓缩得一维组分，称取粒径60微米的新型硅胶基质键合材料5千克，装柱，柱径150mm，柱长200mm,分别用8L10%甲醇水溶液、10L30%甲醇水溶液洗脱，收集30%洗脱组分，真空干燥处理即为7种银杏叶黄酮组分，得到的银杏黄酮组分50克，纯度为75%，占银杏叶质量的 1.0%。银杏黄酮组分含量分别山奈酚-3-0-2”，6”- 二鼠李糖基葡萄糖苷4.5g，占组分的9%，芦丁 5.5g，占组分的11%，槲皮素葡萄糖基鼠李糖苷6g，占组分的12%，山奈酚-3-0-芸香糖苷占6.5g，占组分的13%，异鼠李素-3-0-芸香糖苷7.5g，占组分的15%，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷4.5g，占组分的9%，山奈酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷3g，占组分的6%ο，可制成舒血宁注射液9000支。三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂作为应用时间久、疗效明确、使用安全的中药注射剂，有着广泛的应用，而本发明制得的银杏黄酮组分是三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂中一种重要的原料。而本发明提供的制备方法，过程重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求，可用于舒血宁注射液、银杏叶酊剂原料银杏黄酮组分的制备。申请人:声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，单本发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加，具体方式 的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。 权利要求 1.一种银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法，其特征在于:步骤如下: 1)提取:称取含水量为1%-10%的银杏叶，加入其重量8-12倍，浓度为10%-50%乙醇，20-50°C浸泡提取2-5次，每次1-5天，合并提取液，将提取液浓缩得到相对密度为.1.15-1.25 的浸膏； 2)醇沉:将浸膏中加入乙醇使乙醇体积浓度达到50-70%，并充分搅拌，0-4°C冷藏静置12-36小时，过滤，将滤液浓缩至相对密度为1.10-1.25的浸膏；再加入乙醇使乙醇体积浓度达到70-90%，并充分搅拌，0-4°C冷藏静置12-48小时过滤，将滤液浓缩挥发除去乙醇，浓缩得到相对密度为1.15-1.25的浸膏； 3)水沉:将醇沉完的浸膏中按照1:5-1:10的体积比加入水，充分搅拌，0-4°C冷藏静置24-240小时，过滤，样品溶液经过10000-25000转/分钟的高速离心机离心，样品浓缩至相对密度为1.05-1.10的浸膏； 4)大孔树脂分离:将水沉完的浸膏上样于非极性大孔树脂柱，上样量与分离材料体积比为1:5-1:50，分别采用不同体积浓度的乙醇水溶液作为洗脱液，分别采用水、体积浓度10-30%乙醇、体积浓度30-60%乙醇和60-90%乙醇洗脱，每次洗脱的体积为3_6个柱体积，流速为1-3个柱体积/小时；收集10-30%乙醇和60-90%乙醇洗脱组分，合并洗脱液并浓缩至相对密度为1.10-1.20的浸膏； 5)新型硅胶基质键合材料的二维液相色谱制备:以粒径10-100微米的新型硅胶基质键合材料为填料，以不同体积浓度的甲醇水溶液作为洗脱液，收集目标洗脱组分为一维组分，再以粒径为5-80微米的新型硅胶基质键合材料为填料，以不同体积浓度的甲醇水溶液作为洗脱液，收集目标洗脱组分为二维组分，干燥处理即为银杏黄酮组分化合物。 2.根据权利要求1所述的银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法，其特征在于:所述步骤3)中，提取物水沉工艺结束后，先通过转速为10000-25000转/分钟的高速离心机离心，再进行大孔树脂分离。 3.根据权利要求1所述的银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法，其特征在于:所述步骤4)中，大孔树脂的型号为非极性聚苯乙烯型，大孔树脂分离洗脱时，其目标组分采用体积浓度为10-30%乙醇和60-90%乙醇溶液洗脱，并将两种洗脱液合并浓缩。 4.根据权利要求1所述的银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法，其特征在于:所述步骤5)中，一维制备采用的洗脱液为不同体积浓度的甲醇水溶液，甲醇的体积浓度变化范围为15-60%，二维制备采用的洗脱液为不同体积浓度的甲醇水溶液，甲醇的体积浓度变化范围为10-50%。 5.根据权利要求1所述的银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法，其特征在于:所述制备得到的银杏叶黄酮组分为山奈酚-3-0-2”，6”- 二鼠李糖基葡萄糖苷，芦丁，槲皮素葡萄糖基鼠李糖苷，山奈酚-3-0-芸香糖苷，异鼠李素-3-0-芸香糖苷，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷以及山奈酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷，其总含量占银杏叶质量的.1.0-3.5%，得到的银杏黄酮组分纯度在70%以上，其中山奈酚-3-0-2”，6”-二鼠李糖基葡萄糖苷占7-11%，芦丁占8-12%，槲皮素葡萄糖基鼠李糖苷占12-16%，山奈酚-3-0-芸香糖苷占13-15%，异鼠李素-3-0-芸香糖苷占15-18%，，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷占9-11%，山奈酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷占6-9%。 全文摘要 本发明提供了一种银杏叶中高纯度黄酮组分的高效提取分离制备方法，其主要的成分是山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷，芦丁，槲皮素葡萄糖基鼠李糖苷，山奈酚-3-O-芸香糖苷，异鼠李素-3-O-芸香糖苷，槲皮素对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷以及山奈酚对香豆酰基葡萄糖鼠李糖苷。其制备方法为将银杏叶药材粉碎后醇水溶液提取，浓缩后滤液经非极性大孔吸附树脂柱层析，再经新型硅胶基质键合材料进行二维分离，用甲醇溶液洗脱，收集洗脱液并浓缩干燥，获得银杏黄酮组分。本发明提高了目标成分含量，黄酮组分含量确定。提取分离工艺过程重复性高、可操作性好，适用于自银杏叶大规模分离制备黄酮组分，并可作为舒血宁注射液原料。 文档编号A61P25/00GK103110670SQ201210407520 公开日2013年5月22日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日 发明者丰加涛, 付冬梅, 王海涛, 冯志琼 申请人:北京华润高科天然药物有限公司。