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杨路路，苟思琪，张前，李志文 译，黄文斌 校 译者按：免疫检查点抑制剂治疗是当前恶性肿瘤治疗的一个重要里程碑。基于PD-L1检测的几种免疫治疗药物已经被FDA等全世界多个机构批准用于NSCLC的治疗。PD-L1免疫组化检测作为预测免疫治疗疗效的一种生物标记物也得到了广泛的应用。但PD-L1检测还存在一些问题。本文是IASLC病理委员会根据对2019年肺癌PD-L1检测进行了广泛的文献复习，并对检测中可能存在的问题进行分析，并提出了一些解决方案。我们组织翻译该篇文献，目的是让国内病理医生能够及时掌握PD-L1检测在肺癌中的价值，以便更好地指导日常临床病理工作。 摘要 近年来，免疫检查点抑制剂(ICI)在治疗晚期或转移性非小细胞肺癌患者方面取得了可喜的进展。大多数ICI靶向PD-1/PD-L1轴，目的是恢复抗肿瘤免疫。ICI的多项临床试验是通过免疫组织化学(IHC)检测了肿瘤细胞和/或肿瘤浸润性免疫细胞中PD-L1蛋白表达的预测价值，对此应用了具有特定IHC平台的不同检测。其中，一些PD-L1 IHC检测已经被证实用于一线或二线治疗的相应药物的处方。然而，并不是所有的实验室都配备了专用平台，许多实验室建立了内部或实验室开发的检测，这些检测比通常昂贵的临床试验验证的检测更加实惠。尽管PD-L1 IHC检测目前已在大多数病理实验室中开展，但它作为一种预测性生物标志物，其适当的实施和解释至关重要，由于有多个抗体克隆号和可用的平台或检测方法，以及提供的样本通常很小，因此PD-L1的检测可能具有挑战性。自肺癌中PD-L1免疫组织化学检测IASLC图谱发布以来，已经发表了许多文章，这篇由IASLC病理委员会提供的综述更新了2019年ICI在肺癌治疗的适应症，并讨论了PD-L1 IHC检测的分析前、分析中和分析后方面的重要影响因素，包括标本类型、分析的验证、外部质量保证和培训。 前言 肺癌是世界范围内癌症相关死亡的主要原因。这可能是因为大多数患者处于疾病晚期，仅能采用化疗和/或放疗。直到最近，一些肿瘤患者由于有针对性的致癌基因改变，如EGFR和BRAF突变或ALK和ROS1重排，才有了额外的治疗选择。自2014年以来，针对程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和程序性死亡配体1(PD-L1)轴的免疫疗法作为单药治疗或与化疗或其他免疫检查点抑制剂联合治疗在临床试验中获得了评估。这些研究报告道了15-25%的非小细胞肺癌(NSCLC)患者明显受益，无进展生存期(PFS)和/或总生存期(OS)增加。这些免疫疗法现在可以在常规临床实践中使用，一些个生物标记物可以预测临床反应。其中，免疫组织化学(IHC)法检测PD-L1的表达作为一种可预测的生物标志物在临床试验中已被广泛评价。它现在作为抗PD-1和PD-L1药物的伴随或补充诊断，以识别更有可能从该治疗中受益的患者。这是IASLC病理委员会对2019年内PD-L1 IHC检测的科学回顾，以讨论影响PD-L1检测作为预测性生物标志物的质量的几个问题。 1.2019年肺癌（NSCLC和SCLC）免疫治疗的适应证 以免疫治疗为基础的治疗策略适用于肺癌的以下情况：转移性NSCLC的一线和二线或后线治疗，以及在美国和日本，作为单药免疫治疗用于不能手术切除的局部晚期NSCLC不适合手术或明确放化疗的一线治疗；作为单药免疫治疗用于转移性小细胞肺癌(SCLC)的三线或后线治疗联合化疗用于转移性NSCLC和SCLC的一线治疗；作为单药免疫疗法，用于放化疗后无进展的不能切除的局部进展期III期NSCLC的巩固治疗，(关于特定国家中每种药物的监管批准状态和PD-L1 IHC要求，见表1A和B）。 表1A Pembrollizumab单抗和需要的PD-L1免疫组化检测在选择的国家/地区的监管批准状态  1)A,已批准; A*,已批准，但尚未报销; NA,未批准, 2)Companion，伴随诊断;NR,不需要;缩写：NSCLC,非小细胞肺癌; SCC,小细胞肺癌; SQC,鳞状细胞癌, TPS,肿瘤比例评分 表1B Nivolmab, Atezolizumab和Durvalmab单抗和需要的PD-L1免疫组化检测在选择的国家/地区的监管批准状态  1)A,已批准; A*,已批准，但尚未报销; NA,未批准, 2)Companion，伴随诊断;IVD,体外诊断(需要报销)；NR,不需要 缩写：IC,肿瘤浸润性免疫细胞;NSCLC,非小细胞肺癌; SCC,小细胞肺癌; SQC,鳞状细胞癌, TC,肿瘤细胞; >TC0/IC0,PD-L1在≥1%肿瘤细胞表达和/或≥1%肿瘤区域伴有PD-L1阳性免疫细胞;TPS,肿瘤比例评分 1a. 转移性NSCLC：一线治疗 帕博利珠单抗(Pembrolizumab)被批准为治疗无EGFR/ALK改变的转移性NSCLC患者的一线治疗。采用IHC检测肿瘤细胞上PD-L1的表达被用于筛选患者。KEYNOTE (KN) 024试验将305名诊断为NSCLC，且无靶向的EGFR/ALK改变，并且至少50%的癌细胞(肿瘤比例评分[TPS] ≥50%)上表达PD-L1，随机分组分别接受帕博利珠单抗或多达6个周期的标准双铂化疗；帕博利珠单抗达到了PFS的主要终点（10.3个月vs 6.0个月；危险比[HR]=0.5，95%CI:0.37-0.68，p<0.001），导致中位OS时间为30.0个月vs化疗的14.2个月（HR=0.63，95%CI:0.47-0.86，p<0.001。KN 042试验采用了类似的设计，只是招募病人时采用了较低的PD-L1表达截断值（TPS≥1%），队列之间禁止交叉，并纳入了不适合手术切除或明确放化疗的III期NSCLC患者。这项临床试验表明，在1274名患者中，与化疗相比，帕博利珠单抗显著改善了OS（16.7个月对12.1个月，HR=0.81，95%CI:0.71-0.93，p=0.0018）。基于KN 042试验结果，帕博利珠单抗在美国和日本被批准用于野生型EGFR/ALK且PD-L1 TPS>1%的IV期NSCLC患者的一线治疗，但帕博利珠单抗的大部分疗效是由PD-L1 TPS>50%的NSCLC患者引起。根据KN 189和KN 407的临床试验结果，帕博利珠单抗联合化疗还被批准用于非鳞状细胞和鳞状细胞NSCLC。在KN189中，616名非鳞状NSCLC患者随机接受帕博利珠单抗或安慰剂联合铂类/培美曲塞治疗，在完成4个周期后，患者继续接受帕博利珠单抗或安慰剂加培美曲塞作为维持治疗；三重方案显示PFS（8.8个月vs 4.9个月，HR=0.52，95%CI:0.43-0.64，p<0.001）和OS（22.0个月vs 10.7个月，HR=0.49，95%CI:0.38-0.64，p<0.001）显著改善。值得注意的是，无论PD-L1的表达水平如何，都可以看到显著的生存益处。在KN407试验中，559名鳞状细胞NSCLC患者中，随机接受帕博利珠单抗或安慰剂加卡铂和紫杉醇或nab-紫杉醇治疗。帕博利珠单抗联合化疗可明显改善PFS和OS时间（HR=0.56，95%CI:0.45-0.70，p<0.001，HR=0.64，95%CI:0.49-0.85，p<0.001，各自的）。 在一些地区(例如欧洲和日本)，阿特珠单抗被批准与铂-紫杉醇-贝伐单抗化疗联合，用于治疗非鳞状NSCLC，包括TKIs治疗后的EGFR/ALK阳性肿瘤。在其他国家，该批准仅限于没有EGFR/ALK改变的肿瘤。一项三臂IMpower150的研究显示，阿特珠单抗、贝伐单抗、卡铂和紫杉醇(n=356)在PFS(8.3个月比6.8个月；HR=0.62，95%CI：0.52-0.74，P<0.001)和OS(19.2个月比14.7个月；HR=0.78，95%CI：0.64-0.96，P=0.02) 上高于贝伐单抗、卡铂和紫杉醇（n=336）。其他使用阿特珠单抗加化疗——IMpower 130中的铂类/nab-紫杉醇，或IMpower 132中的铂类/培美曲塞-截至2019年9月尚未获得任何批准。 1b.转移性 NSCLC：二线和后线 对于没有预先接受抗PD-1/PD-L1药物的患者，以下药物已在二线和后线中获得批准：与PD-L1表达状态无关的纳武利尤单抗和阿特珠单抗，以及仅限于PD-L1阳性肿瘤的帕博利珠单抗(TPS≥1%)；这些药物在未接受免疫治疗的患者中的使用是基于里程碑式的三期随机试验（CheckMate 017和057，KN 010和OAK研究），这些试验将这些药物与多西他赛进行了比较，显示了生存益处。 1c.局部进展性NSCLC 德瓦鲁单抗被批准为化疗结束后无疾病进展的不可切除的局部晚期III期NSCLC的巩固治疗；该批准在欧洲和日本仅限于PD-L1阳性肿瘤（TPS≥1%），但在其他地区不适用（表1B）。 III期PACIFIC试验将700名患者随机分为两组，分别接受1年的德瓦鲁单抗或安慰剂，德瓦鲁单抗显著改善PFS（16.8个月对5.6个月；HR=0.52，95%CI:0.42-0.65，p<0.001）和OS（HR=0.68，95%CI:0.47-0.997，p=0.0025）。非计划的事后分析报道了对于TPS<1%的肿瘤，德瓦鲁单抗未能获得有益的OS，导致欧洲和日本批准仅限于TPS≥1%的肿瘤。考虑到PD-L1的表达在PACIFIC试验既不是纳入标准，也不是分层因素，而且只有64%的参与者可以获得基线组织样本，这一结果值得商榷，应该进行前瞻性的验证。 基于上述KN 042试验结果，帕博利珠单抗在美国和日本也被批准用于野生型EGFR/ALK且PD-L1 TPS≥1%，不适合手术切除或明确的放化疗的III期NSCLC患者的一线治疗。 1d.转移性SCLC：一线治疗 在随机3期IMpower133试验证实在铂类/依托泊苷(4个周期)的基础上加用阿特珠单抗可以获得有益的PFS和OS后，阿特珠单抗被批准与铂类/依托泊苷联合应用于进展期的SCLC；在非进展性肿瘤中使用阿特珠单抗作为维持药物。中位 PFS 分别为5.2个月vs 4.3月(HR=0.77，95%CI：0.62~0.096，P=0.02)；中位OS分别为12.3个月vs 10.3个月(HR=0.7，95%CI：0.5~0.91，P=0.007)。所有患者亚组的获益一致；在该项试验中PD-L1的表达并不能预测获益的大小。 CASPIAN采用了类似的设计，联合使用顺铂/卡铂依托泊苷与德瓦鲁单抗，导致OS获益，尽管到2019年9月，德瓦鲁单抗尚未被批准用于这一适应症。 1e.转移性SCLC：三线和后线 帕博利珠单抗虽在美国获得批准，但在其他地区未被批准用于正在接受或在铂类为基础的化疗和至少另一种先前的治疗方案之后发生疾病进展的转移性SCLC。该批准是基于KN 158（队列G）和KN 028（队列C1）两个多中心、多队列、非随机、开放标签试验的汇总数据。83例接受帕博利珠单抗治疗的患者的整体反应率（ORR）为19%（95%CI，11-29），完全缓解率为2%，部分缓解率为17%。在16例有反应的患者中，94%的反应持续时间（DOR）为6个月或更长，63%的DOR为12个月或更长，56%的DOR为18个月或更长。采用PD-L1联合阳性评分（CPS：PD-L1染色细胞数[肿瘤细胞、淋巴细胞、巨噬细胞]除以存活肿瘤细胞总数，再乘以100），16例应答者中有14例PD-L1阳性（CPS≥1）。但是，帕博利珠单抗在该情况中的批准与PD-L1表达状态无关。 总之，免疫治疗已被批准用于NSCLC和SCLC的许多治疗适应症；值得注意的是，多个试验正在进行中，并将于2019年底报告，并可能扩大各种药物、联合和临床适应症的治疗选择。 2.PD-L1表达：预测和预后的生物标志物 2a. 预测性生物标志物 由于仅15%-25%的晚期NSCLC患者能从免疫治疗中受益，因此需要一种预测性的生物标记物来选择可能有反应的患者。IHC检测PD-L1蛋白表达是大多数免疫肿瘤学（IO）临床试验的预测性生物标记物（图1和表2）。一般来说，PD-L1高表达的肿瘤患者比低表达或不表达的患者表现要好。然而，我们必须知道的是，PD-L1表达仍是一种不完善的生物标志物，这是因为其是一个连续变量，在一定条件下可诱导，且具有一定程度的时空差异性。此外，重要的需要注意的是PD-L1IHC的截断值通常是根据相应的临床试验数据获得的事后分析确定的。当使用如X-Tile的软件时，可根据所获得的数据任意计算截断值。但这并不是一个验证预测性标记的好方法，常会引起较低的重复性。  图1.PD-1/PD-L1阻断的关键临床试验小结； Non-squamous，非鳞状非小细胞肺癌；squamous，鳞状细胞癌；Pembro，帕博利珠单抗；mono，单药疗法；Atezo，阿特珠单抗；bev，贝伐单抗；pac，紫杉醇；carbo、卡铂；nab-pac，nab-紫杉醇；cis/carbo、顺铂/卡铂；pem，培美曲塞；Nivo，纳武利尤单抗；Plat chemo，双铂化疗；CIT，检查点抑制剂疗法；ipi，伊匹单抗；TPS，肿瘤比例评分；TC，肿瘤细胞；IC，肿瘤浸润免疫细胞；TC3或IC3，TC ≥ 50%或 IC≥10% PD-L1 ；TMB，肿瘤突变负荷 表2A 晚期NSCLC一线免疫检查点抑制治疗的临床试验结果  Pembro，帕博利珠单抗;Nivo,纳武利尤单抗;Atezo, 阿特珠单抗; TPS，肿瘤比例评分；TC，肿瘤细胞；IC，肿瘤浸润免疫细胞；；TC3或IC3，TC ≥ 50%或 IC≥10% PD-L1 ；Plat,铂类药物; Plat chemo，双铂化疗；PFS,无进展生存; OS,总生存；HR,危险比 表2B 晚期NSCLC一线结合免疫治疗的临床试验结果  Non-SQ, 非鳞状细胞癌;SQ,鳞状细胞癌;Nivo,纳武利尤单抗;lpi, 伊匹单抗; Durva,度伐利尤单抗;Tremi,pembrolizumab; Chemo, 化疗; Atezo,阿特珠单抗; Bev,贝伐单抗; Pac, 紫杉醇; Carbo, 卡铂; Nab, Nab-紫杉醇; TPS,肿瘤比例评分; TMB, 肿瘤突变负荷; Mb, 宏碱基; Plat, 铂类; Plat Chemo, 铂双联化疗; Nab Paclitax, Nab-紫杉醇; PFS, 无进展生存; OS, 总生存; HR, 危险比; H-TMB, 高肿瘤突变负荷 在KN 024研究中，比较帕博利珠单抗和化疗组，PD-L1≥50%的肿瘤患者的PFS和OS明显较长。这些发现改变了晚期NSCLC一线治疗的治疗标准。随后，根据KN 189、KN 407以及Impower 150的研究结果，无论PD-L1表达情况如何，免疫治疗联合化疗被批准为一线治疗。KN042试验采用较低PD-L1截断值(TPS≥为1%)，结果发现与化疗相比，帕博利珠单抗能显著提高患者OS。因此，在美国和日本，基于1%的截断值，帕博利珠单药治疗已经获得批准。然而，OS获益仅见于PD-L1 TPS≥50%的受试者，在TPS介于1%和49%之间的肿瘤患者中不明显。下一步的关键问题是，在PD-L1 TPS≥50%亚组中，化疗联合免疫治疗是否优于单纯免疫治疗。比较研究尚未见报道，两者都被认为是标准治疗方案。在临床实践中，PD-L1高表达（≥50%）的肿瘤患者通常单独使用帕博利珠单抗治疗，除非存在某些临床因素（如明显的肿瘤或症状负荷），并影响提供者使用化疗加PD-1抑制剂组合。相比之下，在PD-L1表达较低（<50%）的患者中，免疫治疗联合化疗在大部分临床背景下被认为是标准疗法。因此，在联合治疗实施后，PD-L1检测已成为决定晚期NSCLC患者在帕博利珠单抗治疗、免疫治疗和化疗联合治疗之间的一线治疗策略的重要手段。 关于二线或之后的治疗方案，一项包括5项3024名患者的荟萃分析（KN 010，CheckMate 057，CheckMate 017，poark和OAK）表明，与多西他赛相比，免疫治疗提高了不同PD-L1表达水平患者的OS。然而，对于PD-L1表达<1%的患者中，仅极少量的数据提示纳武利尤单抗或阿特珠单抗对个体化治疗有益处，PD-L1亚组提示PD-L1表达水平与生存之间存在正向剂量-反应关系。此外，与未选择的PD-L1人群相比，PD-L1≥10%和≥50%的亚组也有生存益处。 2b. 预后的生物标志物 多项研究已表明了PD-L1表达对预后的影响，主要是对于手术治疗的NSCLC患者，产生相互矛盾的结果。这可能是由于研究队列、肿瘤分期、组织学亚型、PD-L1 IHC检测方法和这些研究中应用的cut-offs值的差异所致。然而最近的一项荟萃分析（包括50项对11383名肺癌患者的研究）显示，PD-L1 IHC的表达与患者总体较短OS相关（HR:1.45，95%CI:1.24-1.68）。一项在亚洲进行的亚组分析中发现，PD-L1阳性组患者的OS显著缩短，尤其在切除标本中检测到PD-L1表达、以5%为cut-off值、患者有早期（I-III）肿瘤时。此外，PD-L1的表达与NSCLC、腺癌、鳞状细胞癌和淋巴上皮瘤样癌中患者较短的OS相关，但与小细胞癌无关。 3.临床试验验证性分析 基于临床试验结果，几种抗PD-L1检测方法已批准作为伴随或补充免疫组化检测用于福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的肿瘤组织中，用于抗PD-1或抗PD-L1药物治疗NSCLC。伴随诊断是在开始治疗前必须进行的强制性检测。相反，补充性检测有助于治疗的决策过程，但在开具处方相应药物时不是必需的。 3a.22C3检测 F美国DA已批准克隆号为22C3（DAKO；PD-L1 IHC 22C3 PharmDx）作为帕博利珠单抗（KEYTRUDA®）治疗晚期NSCLC的伴随诊断试剂。22C3 PharmDx检测在欧洲也获得了CE-IVD（体外诊断的符合欧洲标准标记）认证，并获得日本药品和医疗器械署（PMDA）对帕博利珠单抗治疗的批准（有关特定国家/地区的检测监管批准状态，见表1A）。PD-L1 IHC 22C3 PharmDx在FFPE组织上使用单克隆小鼠抗PD-L1抗体（克隆号22C3）。检测应使用DAKO Autostainer Link 48上的EnVision FLEX可视化系统进行。必须至少有100个活性的肿瘤细胞进行评估。PD-L1 IHC 22C3 PharmDx评估显示部分或完全膜染色的有活性肿瘤细胞百分比（TPS）。如TPS≥1%，则为PD-L1表达；如TPS≥50%，则为PD-L1高表达。 3b.28-8检测 PD-L1 IHC 28-8 PharmDx被美国FDA批准作为纳武利尤单抗（OPDIVO®）的补充诊断，用于曾接受过含铂化疗或FDA批准的靶向药物治疗及肿瘤存在EGFR或ALK突变（见表1B获得监管批准选定国家/地区的分析状况）的晚期非鳞状细胞NSCLC患者治疗。PD-L1 IHC 28-8 PharmDx在FFPE组织上使用单克隆兔抗PD-L1抗体（克隆号28-8）。检测方法和要求与PD-L1 IHC 22C3 PharmDx相同。对于非鳞状细胞NSCLC，PD-L1 采用TPS评分，分别报告为<1%，≥1%，≥5%或≥10%的分点。 3c.SP263检测 VENTANA PD-L1(SP263)检测在欧洲获得了德瓦鲁单抗(IMFINZI®)、帕博利珠单抗和纳武利尤单抗疗法的CE-IVD认证(有关该检测在各个国家/地区的监管批准状况，请参阅表1A和B)。该检测在FFPE组织上使用单克隆兔抗PD-L1（克隆号SP263）。检测试剂盒应在VENTANA BenchMark ULTRA仪器上使用。在非小细胞肺癌中，这种检测的结果通常采用TPS报告，截断值由抗PD-1/PD-L1药物和对其进行检测的适应症决定。 3d. SP142 检测 VENTANA PD-L1（SP142）试验已获得欧盟委员会、FDA和85多个国家的批准作为补充检测，用于阿特珠单抗(TECENTRIQ®)治疗以前治疗的转移性NSCLC（有关选定国家/地区的试验监管批准状态，见表1B）。PD-L1≥50%的肿瘤细胞（TC）或≥10%的肿瘤浸润免疫细胞（IC）上的表达可能与阿特珠单抗治疗提高的总生存率相关。该检测采用兔抗PD-L1单克隆抗体(克隆SP142)在FFPE组织中进行检测。该检测试剂盒应在VENTANA BenchMark ULTRA仪器上进行。该项检测应在TC和IC中PD-L1表达来解读。TC评分为显示任何强度的PD-L1膜染色的有活力肿瘤细胞的比例。IC评分为PD-L1表达任意强度的免疫细胞所占肿瘤面积的比例。评分是以循序渐进的方式进行的。首先评估TC染色，如TC为≥50%，则该病例将被指定PD-L1表达水平为≥50%TC(TC3)。如TC<50%，则评估IC染色。如IC占肿瘤面积的10%，则该病例的PD-L1表达水平定为 > 10% IC (IC3)。如果 IC＜10% ，则该病例的PD-L1表达水平将大于10%IC（IC3）。如果IC<10%，则该病例的PD-L1表达水平为<50%TC（TC0,1,2）和<10%IC（IC0,1,2）。 4．可能影响PD-L1免疫组化的分析前因素（表3） 表3：PD-L1免疫组化最佳的分析前条件*  *：这些都是理想的条件，可在各个实验室进行验证，以获得较好的执行特征。 #：PD-L1免疫组化在脱钙组织和细胞学标本上可能获得验证。 4a.一般条件 一般来说，冷缺血时间（CIT）、固定液的多少和质量、固定时间、白片或蜡块的储存条件和存放时间是IHC优化的重要因素。CIT是从活检组织取出到浸入固定液之间的时间间隔。术后应尽量缩短其它流程，减少冷缺血时间。根据美国临床肿瘤学学会和美国病理学医师学会（CAP）的鼓励， 推荐的CIT用于分子分析的时间要小于60分钟。最近发表的研究显示延长固定时间可导致PD-L1膜表达减少，而过度固定对免疫组化染色没有影响。 虽然10%中性缓冲福尔马林（NBF）是理想的固定液，但对于Ventana SP263检测，福尔马林锌可以作为替代品。相比之下，酒精-福尔马林-乙酸（AFA）、PREFER固定液和其他含酒精的固定液在所有检测的固定时间（1-72小时）都显示PD-L1的特异性染色丧失，不推荐用于SP263和SP142的检测。此外，在细胞学样本中使用的基于酒精的Cytolyt(HOLOGIC INC，) 马萨诸塞州马尔伯勒)或CytoRich Red Collection Fluid(ThermoFisher Science，Waltham，Massachusetts)溶液在某些情况下可能导致PD-L1蛋白的异常定位。 组织标本应浸入足够体积的固定液中，固定液与组织的最佳比例至少为10:1。虽然在活检标本固定时间6-48小时、切除标本固定时间24-48小时可以获得最佳的IHC结果，但22C3和28-8的PharmDx试剂盒和Ventana SP263抗体的使用手册建议用NBF固定至多72小时。这些检测方法在石蜡包埋的标本，4-5μm厚度切片以及使用正电荷载玻片中得到了验证。理想情况下，切片应在切完后尽快染色，建议在两个月内染色。然而，如果切片在2-8℃下保存，试剂制造商发现在长达12个月的切片中仍可得到满意的染色效果。应避免长期保存未染色的组织切片，以确保PD-L1 IHC的最佳结果。据报道，在储存超过1-3年的石蜡块中PD-L1表达减弱，这可能与储存期间暴露在光照条件和潮湿环境中引起的氧化或抗原降解有关。尽管所有可用的IHC检测方法尚未对脱钙组织进行验证，但最近一项使用22C3抗体的研究显示，在2275个骨标本中PD-L1免疫的表达与其他身体部位的表达情况没有显著的差异。总的来说，PD-L1的分析前因素应与其他预测性免疫组织化学试剂（如ALK、ROS1和BRAF V600E）以及分子检测相似。 4b.标本和肿瘤内的异质性 4b-1.活检标本与手术切除标本 一些研究表明，在NSCLC中PD-L1表达可表现为肿瘤内和肿瘤间（原发部位与转移部位）的异质性。鉴于这种异质性，准确反映肿瘤PD-L1状态的组织取样是一个重要问题。对于不能手术的NSCLC患者，是否可以进行免疫治疗可能仅根据小活检标本中PD-L1表达情况来决定。然而，与较大标本的全切片相比，活检标本可能并不能代表PD-L1的总体表达情况，这是因为在最初的采用SP142克隆号的研究中发现活检标本与切除标本的一致率约50%，采用其他克隆号的一致率约在70%至90%之间。特别是最近的一项研究报道了配对的小活检和随后切除的标本，分别使用22C3和SP263克隆号进行IHC分析中，当采用1%截断值时，活检和手术切除标本PD-L1一致率分别为96%和91%；而当截断值为50%时，则一致率分别为73%和80%。有趣的是，Munari等使用SP263 IHC法比较了268例NSCLC患者组织芯片和相应全切片的PD-L1表达水平，研究表明在截断值分别为1%和50%时，最少分别需要4个和3个组织核芯才能获得与全切片一致的结果（灵敏度>90%）。此外，最近的一项研究表明，为了评估PD-L1的表达并预测患者对nivolumab治疗的反应，一次活检标本中至少需要有100个肿瘤细胞。对于切除标本，基于Rehman等证实35例切除的NSCLCs中，3个独立的蜡块之间的肿瘤细胞PD-L1染色一致性为94%的研究结果，单个蜡块的切片染色可能足以反映PD-L1在整个肿瘤中的表达。 4b-2. 细胞学标本与组织学标本 另外一个问题是在实际工作中，微创手术已越来越多地用于晚期NSCLC的诊断和辅助研究中；因此，相当一部分NSCLC患者可能只有细胞学标本用于PD-L1的检测。虽然在细胞蜡块或其他细胞学制片中进行PD-L1检测尚未被广泛接受，但有一些研究分析了配对的细胞学和组织学样本中PD-L1表达的一致性。较高的不一致性见于相应的切除标本内的异质性染色。差异的另一个原因可能是由于细胞学和组织学检查间隔的时间长，导致肿瘤细胞在不同的阶段和/或免疫状态被取材。此外，有时会使用非福尔马林固定液收集细胞学标本，如上所述，酒精固定的样品在各种IHC抗体中阳性较低。最后，细胞蜡块和细胞学涂片具有较高的观察者间的差异。尽管存在这些潜在的混杂因素，大多数基于细胞学标本（有或无细胞蜡块）的研究发现，细胞学标本和组织学标本之间的PD-L1表达水平存在良好的相关性，并且与免疫治疗的客观临床反应也存在相关性。此外，BluePrint 2A阶段的研究证实了来自31例NSCLC患者的手术切除标本、小活检样本和细针抽吸细胞蜡块的三种样本的可比性。大多数在细胞学标本中PD-L1的研究使用FNA或渗出液/冲洗液来源的细胞蜡块，而少数研究使用的是直接涂片和液基细胞学涂片。 尽管所有类型的细胞学制片都被认为适合PD-L1的检测，但细胞学标本的使用尚未在临床试验中得到证实。因此，应首先对细胞学标本的适当方案进行验证，并且做好质量控制。对于在FFPE活检标本中进行实验室开发的检测（见下文），建议与批准的检测和水平测试进行交叉比较。如果细胞学实验室提供不止一种方式（如细胞离心和细胞蜡块），则需要相应地开发具有任何预处理的方案，包括多种固定剂的抗原修复条件和稀释液的优化。对于与临床材料一起固定和处理的细胞蜡块，代表着PD-L1从无表达到高表达的表达值范围的外部对照可用于此项检查，这对于PD-L1抗体在组织切片上具有很好表达的病例特别重要，但在细胞学标本中的免疫反应需要进行比较和对比。标本大小也很重要，因为小样本在1%阈值时有低估PD-L1 IHC表达的趋势。因此，在将来的研究中，活检组织取样越来越多、记录活检组织的大小和肿瘤负荷可能允许PD-L1检测的进一步的细化，提高预测的准确性。 4c.肿瘤间的异质性（原发性肿瘤与淋巴结和远处转移的肿瘤） ATLANTIC试验评估了肿瘤间的异质性，在以25%截断值的情况下，PD-L1阳性肿瘤细胞在原发灶和转移灶之间具有相似的阳性率（35%和33%），一致性为89%。Mansfield等检测了来自73例患者配对的原发灶和脑转移灶共146个标本中PD-L1的表达情况，他们发现肿瘤细胞PD-L1表达（14%，k=0.71）和肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）PD-L1表达（26%，k=0.38）存在显著差异。重要的是，大多数肿瘤细胞PD-L1表达不一致的配对病变获得标本的时间间隔在6个月或以上。同样，Munari等用克隆号SP263比较了84例NSCLC原发灶和复发灶中PD-L1的表达情况，75对原发性和转移性肿瘤在1%和50%的截断值时分别存在12%和9.3%的差异；进一步比较9例原发性和局部复发病灶中PD-L1表达，在1%和50%的截断值时，分别有33%和11%的病例存在差异。总之，在NSCLC中报道的肿瘤间PD-L1表达的一致率在67%到90%之间，可能是由于研究队列、IHC检测方法和采用的截断值差异引起的。 关于原发性肿瘤和淋巴结转移，一项研究报道在截断值分别为1%和5%的情况下， 原发灶与淋巴结转移灶中PD-L1一致性表达分别为90%和80%。在另一项研究中，在不同的截断值情况下，原发性肿瘤和N1淋巴结转移之间的PD-L1表达有15%-18%的差异，原发性肿瘤和N2淋巴结转移之间存在9.4%-38%的差异。 4d.化疗/放化疗干预的影响 由于PD-L1是一种免疫相关分子，其表达水平会随着肿瘤微环境的变化而波动。例如，化疗和放化疗可以诱导肿瘤细胞死亡和/或其他变化而引起免疫应答，随后会出现T细胞中PD-1的表达和肿瘤细胞及肿瘤微环境中其他成分PD-L1的表达。一些研究比较了化疗/放疗前后肿瘤细胞PD-L1的表达情况，发现其在表达和变化趋势上（增加/稳定/减少）有广泛差异。在这些报道中，有14～57.1%的病例在化疗后出现PD-L1表达的变化，表达的增加可能与更好的治疗反应或更差的预后相关。Zhang等评估了30例接受顺铂新辅助化疗的NSCLC患者治疗前后的PD-L1 IHC的表达，他们发现化疗后高PD-L1表达的患者与化疗反应差和预后较差相关，表明高PD-L1水平提示治疗抵抗和不良预后。Sheng等对32例NSCLC患者新辅助化疗前后的肿瘤细胞进行PD-L1免疫组化检测，发现以前的化疗可能导致PD-L1表达不一致。在此项研究中，新辅助化疗后肿瘤细胞PD-L1的表达从75%下降到37.5%。此外，Omori等检测了76例NSCLC患者治疗前后PD-L1表达的变化，其中包括13例应用EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗的患者，发现有38%的患者肿瘤细胞PD-L1表达有显著变化。他们还发现，EGFR-TKI治疗可能增加有EGFR突变的NSCLC患者的PD-L1的表达。而最近的一项包括在ATLANTIC试验内的1590例样本的研究显示采样前的化疗或放疗，而不是TKI与PD-L1的表达显著增加有关。 IHC检测 NSCLC组织PD-L1表达的方法非常重要。这是一种半定量试验，PD-L1表达的不同水平（TPS阈值或截断值）可能触发几个不同的抗PD-1或抗PD-L1治疗适应症的资格。重要的是，如果要实现使用这种批准疗法的临床期望，临床使用中的方法要概括临床试验中提供的患者选择。要做到这一点，最简单的方法是使用与预期治疗相关的实际临床试验验证的检测，但这种方法存在几个实际问题(见下文)。或者，实验室可以选择使用自己的检测方法，即实验室开发的检测（LDT）。在这种情况下，以及在使用新批次时的任何检测，对正在进行的实验室性能的监测是必不可少的。这是因为IHC染色程序的技术结果不仅仅是用于组织切片中结合PD-L1分子的原始克隆的功能，而是一系列复杂的化学反应的最终产物，这些化学反应涉及到组织的制备和通过染色原的沉积显示染色。自动染色平台也是这一过程的组成部分。 5a.FDA批准的PD-L1 IHC检测 FDA批准的四种商业PD-L1-IHC检测（22C3、28-8、SP263和SP142）中使用的染色方案都经过了严格的验证过程。因此，它们在临床实施中更加直接，但需要检测特异性的自动化染色平台。考虑到实验室运行多种PD-L1检测的不实际情况，出现了这些检测方法在临床应用中的可比性和互换性问题。 至少有14项研究比较了这些经临床试验验证的商业PD-L1 IHC检测的分析（染色）性能（表4）。9项研究包括28-8检测、10项SP142检测、13项为SP263检测和13项为22C3检测。实际上，几乎所有包括SP142检测的研究表明，与所有其他试验相比，它在检测肿瘤细胞和有时免疫细胞中PD-L1表达的灵敏度较低(图2-图4)。在比较22C3、28-8和SP263检测的8项研究中，有4项在检测肿瘤细胞PD-L1染色时发现这3项检测之间有很好的一致性，而其他的研究则报告了22C3和28-8检测之间一致性最高。相反，另外2项研究报告了22C3和SP263之间具有相似的敏感性。至少有5项研究表明，SP263在检测肿瘤细胞上PD-L1表达方面比28-8和/或22C3检测方法更敏感。 表4 评估FDA批准的商业PD-L1免疫组织化学检测的分析可比性而进行的研究    图2 .实性和腺泡型腺癌的例子。苏木精伊红藏红花染色 (A)，DAKO平台的28.8检测(B)，DAKO平台的22C3检测(C)，Ventana平台的SP142检测(D)和Ventana平台的SP263检测(E)。B,C,E图示肿瘤细胞中50%以上出现PD-L1膜染色(TPS>50%)，而图D示散在免疫细胞但无肿瘤细胞PD-L1阳性(TPS<1%)。  图3 .鳞状细胞癌的例子。苏木精伊红藏红花染色(A)、DAKO平台的28.8检测(B)、DAKO平台上的22C3检测(C)、Ventana平台的SP142检测(D)和Ventana平台的SP263检测(E)。B,C,E图示肿瘤细胞中50%以上出现PD-L1膜染色(TPS>50%)，而图D示散在免疫细胞但无肿瘤细胞PD-L1阳性(TPS<1%)。  图4 .A&B:1例小细胞癌采用DAKO平台的22C3检测染色证实了一小群PD-L1膜染色的肿瘤细胞(箭号)以及阳性的免疫细胞。总的来说，TPS< 1%，CPS < 1 (A: HE, B: PD-L1免疫染色)。C&D:另1例小细胞癌采用实验室开发(Ventana平台的22C3克隆号）显示罕见的肿瘤细胞(箭头)和几个散在的巨噬细胞中PD-L1膜染色。总的来说，TPS<1%，CPS< 1 (C: HE, D: PD-L1免疫染色)。 由于在许多国家/地区，只有帕博利珠单抗单药治疗需要检测PD-L1作为伴随诊断来选择患者进行治疗，22C3 PharmDx检测已成为全球应用最广泛的商业性PD-L1 IHC检测。然而，根据上述讨论的几项试验比较性的研究结果，Ventana PD-L1（SP263）检测在欧洲也获得了CE-IVD认证，用于帕博利珠单抗、德瓦鲁单抗和纳武利尤单抗治疗。尽管关于它们治疗反应的临床等效性的数据有限，但这是普遍接受。然而，在欧洲和日本，对于PD-L1 TPS≥1%，放化疗后考虑接受德瓦鲁单抗治疗的不可切除的III期NSCLC患者，SP263和22C3之间的敏感性差异可能会产生更大的临床影响。 5b.实验室开发的测试（LDT） 实验室可通过选择或必需的方式，使用未经临床试验验证的方法来进行PD-L1 IHC检。在某些国家，经临床试验验证的检测费用较昂贵，且报销不足，实验室可能无法获得经临床试验验证的相应Ventana Benchmark ULTRA或DAKO 48 Link染色平台。根据定义，除了临床试验验证的检测（包括原始克隆、化学和平台的整套检测），任何PD-L1 IHC检测都是LDT。因此，任何LDT都不一定能提供与临床试验验证的检测相同的染色性能。事实上，已经表明至少某些检测结果的变异性更多地是所涉及的辅助化学功能，而不是主要抗体克隆号本身的特性。LDT可以使用临床试验中使用的抗PD-L1克隆号的一种，也可以使用另一种从未验证过的克隆如E1L3N，其仅用于研究(RUO)中被验证，或者QR1，这是被CE-IVD认证，并结合该环境中可用的任何IHC平台，包括 LEICA平台。 有明确的证据表明，LDTs可以合理地与已成为事实标准的试验验证检测(Dako 22C3 PharmDx检测和Ventana SP262检测)的技术性能相匹配。Rimm和他的同事首先证明使用E1L3N克隆的LDT可以与这些检测的技术性能相匹配，但值得注意的是，这一结果是在经过广泛的验证工作后实现的。法国多个中心进行的一项非常大的研究测试了LDT，并证明当与经试验验证的标准检测进行比较时，27个LDT中的13个(48%)，基于28-8，22C3，SP142和E1L3N克隆号出现了变异，使用相对适度的Kappa分数>0.75，未能充分匹配标准检测的性能。现在已经有几篇文章发表，描述了使用原始克隆号和平台的不同组合的LDT，声称其性能与临床试验验证的标准相当。如果实验室选择或被迫开发LDT，或使用已公布的LDT，则必须根据适当的标准进行充分的验证。这个问题在别处已经讨论过了。美国病理学家学会(CAP)提供了开发用于治疗的LDT的一般指南，建议至少检测20例阳性/20例阴性病例。然而，考虑到染色的完整动态范围和该生物标记物对“阳性”的多重重合定义，这是值得商榷的。在PD-L1 IHC定量评估的范围内，该验证应优先包括PD-L1表达在每个临床重要截断值附近的重要病例，即1%和50%。一种实用的方法是用LDT和诊断性检测对连续20个临床样本进行染色，预期有80%-90%的样本结果一致，仅有2到3个样本在强度上显示局灶性不一致，这可以用于LDT的进一步精确。 5c.质量保证策略和计划 无论采用何种方法提供PD-L1 IHC服务，都需要高质量的验证和测试。使用商业化检测，而不是LDT的决定并不能保证持续的成功；仍然有可能在实验室中出错并误判PD-L1染色结果。确保高质量PD-L1 IHC的内部实验室的步骤至关重要。仔细注意标本固定和处理是良好实践的一般步骤，对于PD-L1 IHC没有具体的建议。需要强制性使用阳性对照，最好是“在玻片上”，而检测标本中任何可能的内部对照，例如肺泡巨噬细胞，都可以进行预期的染色评估。此外，强烈建议对报告的染色评分范围进行监测；当使用经试验验证的22C3或SP263或相同的检测时，不到50%的病例显示TPS<1%，20%到30%的病例显示TPS≥50%。 参与外部质量保证(EQA)计划也是极其重要的，在一些国家，这是临床服务的强制性要求。EQA还特别说明了使用LDT的问题，并在提高用户的IHC质量性能方面发挥了作用。全球有几个PD-L1 IHC EQA方案获得，网站提供了更多针对PD-L1 IHC的早期方案的信息。 6.分析后影响因素 6a.判读者自身及判读者之间的差异 由于检测评分采用半定量，所以PD-L1的免疫组化结果易受判读者之间差异的影响。几项研究调查了病理学家（至少3名）对各种PD-L1检测评分是否一致（表5）。总的来说，各种检测方法对PD-L1 TC评分的一致性较好，但对NSCLC IC评分的一致性较差。 表5 PD-L1在NSCLC中肿瘤细胞(TC)和免疫细胞(IC)评分的病理一致性 NSCLC非小细胞肺癌; OPA, 总体一致性百分比; ICC, 组内相关系数; TMA, 组织微阵列; PABAK, 患病率调整偏差调整kappa *1.5天，对肿瘤细胞没有特异性分析 **Score 0 <1%, score 1 1–4%, score 2 5–9%, score 3 10–24%, score 4 25–49%, or score 5 ≥50%阳性肿瘤细胞。 在BluePrint 的二期研究中，经过1.5天培训的24名肺病理学家（IASLC病理委员会成员）用5种经过试验验证的PD-L1检测方法对71例临床NSCLC样本进行评估。所有检测方法对PD-L1 TC评估均具有良好的一致性，组内相关系数（ICC）为0.86至0.95。重要的是，细胞学标本中TC的评分也有很好的一致性(ICC 0.78-0.85)。在上述Rimm及其同事对90例NSCLC切除标本的研究中，由13名病理学家对TC进行PD-L1评分，结果显示4种不同的检测方法的结果高度一致，ICC范围为0.83-0.88。对于二次评估，使用Fleiss kappa统计学处理，病理学家的一致性在50%截断值为0.75，在1%截断值为0.54。另外一些研究表明，将个别病理学家的评分与共识评分进行比较时，50%的截断值与1%的截断值(0-5例vs 20%的病例)进行区分的病例数量明显减少。 相比之下，在评估22C3时，其他人发现1%截断值的一致性高于50%截断值(Light的kappa值为0.74 vs 0.66)。在Cooper等研究中，与50%的截断值相比，1%截断值的一致性略高， Cohen’s的kappa值（普遍经过细微的调整）分别为0.68和0.58。在使用22C3 PD-L1 PharmDx试剂盒对120例NSCLC的研究中，10名有一定经验(中位数为15年)的病理学家被发现在1%截断值上总体一致性(OPA)为84.2%，50%的截断值总体一致性为81.9%。选择的病例包括相同数量的高于和低于感兴趣截断值的病例，其中三分之一病例接近截断值。当这些病例被5名病理学家在第2天以不同的顺序进行评估时，病理医师表现出较好的一致性，判读者之间OPA为89.7%。在另一项采用克隆号为28-8的PD-L1实验的研究中，判读者之间的一致性更高，在1%截断值时为90.4%，在5%截断值为97.8%。 很少有研究评估免疫细胞(IC)中PD-L1评分的一致性，但所有研究的一致性都低于TC评分的一致性。在Blueprint Phase 2期研究中，尽管病理学家接受了专门的培训，但ICC在NSCLC标本中的可靠性较差(0.18-0.19)，而SP142法的可靠性最高(0.27-0.28)。同样，在Rimm等研究中，IC评分的一致性较差，ICC值在0.17-0.23之间。尽管本研究的病例中并没有包括阳性和阴性IC的良好分布，但二进制截点kappa评分为0.12-0.25的IC的重复性也很低。对IC评分一致性差可能与应用评分指南和/或对少量阳性细胞评分困难有关。无论何种原因，较差的一致性可能使IC评分难以可靠地纳入临床实践。 这些研究的一个重要不足是，病理医生之间做出的评分比较独立于患者的结果。迄今为止，还没有对不同病理学家的PD-L1评分与患者预后进行比较的研究。 6b.培训的作用 由于NSCLC中PD-L1评分存在许多潜在的陷阱，而且不同的检测方法有不同的评分标准，因此对病理学家进行专门的PD-L1评分培训是非常必要的。各种在线培训课程可从抗体供应商中获得，并建立了正式的“实践”培训课程。此外，一些出版物提供了关于PD-L1评估的详细信息，包括IASLC的PD-L1图谱。虽然一些研究未能显示病理学家PD-L1评分的可重复性与培训或专业知识水平之间的任何关系，但它们通常没有专门设计来调查培训和病理学家教育的影响。在一项对161名法国病理学家进行的真实世界研究中，病理学家的一致性与PD-L1评分的训练以及每周评估的PD-L1检测的数量相关。重要的是，在本研究中，根据胸部病理学实践年数或病理实践类型(私人实验室、社区医院或大学医院)划分的病理学家之间的一致性没有差异。因此，建议病理学家参加一个培训课程，以获得足够的PD-L1评分作为预测生物标志物的可重复性。此外，持续的质量评估对于优化PD- L1评估和患者预后非常重要。 6c.标准化报告和解释规则 一个仔细的和良好注释的报告不仅对PD-L1免疫组化很重要，而且对一般的预测生物标志物检测也很重要。PD-L1免疫组化结果报告应包括标本的一般信息、有关检测方法的相关信息、对照切片结果和患者标本结果。具体的报告细节可根据不同的检测方法而有所不同。一般信息包括患者ID、标本ID、运行日期、肿瘤的组织学诊断、标本类型(活检、手术标本、细胞蜡块)、固定剂以及标本中是否有足够数量的肿瘤细胞。有关检测方法的信息应包括抗体克隆号、自动染色平台，以及是否为商业性检测或LDT。还建议在阳性和阴性对照中提及染色的充分性。在结果部分，PD-L1的表达应该根据每种检测方法的解读手册/指南进行报告。对于22C3、28-8和SP263的检测，建议使用TPS进行报告，同时应有每种检测临床相关的截断值。在SP142检测中，应报告免疫细胞和肿瘤细胞中PD-L1表达的结果。 结论 目前，PD-L1IHC已被确定为非小细胞肺癌中使用多种抗PD-1/PD-L1药物进行一线、二线或后线治疗的预测生物标志物。虽然它可能是一个不完善的生物标记，但自2014年以来，它已经与其他生物学标记一起在绝大多数病理学实验室中得到应用，并被临床医生广泛用于识别有资格接受免疫治疗的患者。因此，为了使PD-L1IHC尽可能可靠，有必要考虑并满足我们在本综述中讨论的多种分析前、分析时和分析后要求的标准。在未来的研究中，取更多和更大的活检标本，记录活检标本大小和肿瘤负荷可能允许进一步细化，提高PD-L1.IHC的预测准确性。 原文出处：Lantuejoul S, Sound-Tsao M, Cooper WA, et al. PD-L1 testing for lung cancer in 2019: Perspective from the IACLC Pathology Committee. J Thorac Oncol,2019 Dec 20[Online ahead of print] 【本站为非盈利学术交流平台，部分资料来源于网络，如涉及版权问题请及时联系管理员处理；所有文章仅供公益交流，不代表本站立场。欢迎提供素材、资料等，投稿邮箱：tougao@，一经采纳将给予稿费。】 责任编辑: 奶糖
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