分享

DNA双螺旋结构模型的建立

 张伟hnufpvr7ob 2020-04-08

1952年,赫尔希和蔡斯的研究明确表明DNA是遗传物质,只有DNA参与噬菌体复制的生化过程。随之而来的问题是:噬菌体是如何完成复制的?这个问题要从噬菌体DNA的两个功能,即自身催化(DNA的自我复制)和异催化(以DNA为模板合成蛋白 质)的角度解决。生化研究很早就揭示了 “自身催化”是一个过程,在这个过程中,一种分子可以以自身为底物进行自我复制、剪切和剪接。通过“自身催化”,噬菌体DNA可以多次复制自己,制造出许多具有遗传指令活性的副本。“异催化”是一种分子催化其他分子形成(或分解)的过程。通过“异催化”,噬菌体DNA以某种方式诱导合成噬菌体特有的蛋白质,这些蛋白质参与和调节着噬菌体生长和装配中的反应。1952年时,还没有人可以确定DNA如何实现这两种功能,或者DNA分子到底具有什么样的性质,使它可以参与这两种完全不同的事件。
功能和结构是紧密联系在一起的,想要了解其功能,必须揭示其结构。作为遗传信息载体的DNA分子,应该具有怎样的结构,才能担负储存遗传信息的任务呢?对这个问题的研究从20世纪50年代一直延续到20世纪60年代中期。正是在这个时期,科学家们将生化遗传学的研究成果与对大分子的研究成果结合了起来,从而推导出DNA的实际结构,并进而推导出DNA的许多功能特性。沃森和克里克的工作在这一时期占据了重要位置。
1948年,沃森来到印第安那大学,师从卢利亚研究噬菌体遗传学。在卢利亚的寓所, 他遇到了德尔布吕克,并深受德尔布吕克的启发。德尔布吕克认为,遗传学的中心问题是研究遗传物质“自身催化”和“异催化”的手段。沃森感到要想知道基因如何发挥作用, 就要知道基因的结构。带着这个想法,沃森去欧洲的一系列博士后站工作。1951年,他在剑桥大学的卡文迪许实验室遇到克里克,开始了最具创造性的合作。
沃森善于集思广益、博采众长,善于用他人的思想充实自己,善于在科学家之间建立有益的互相合作关系;克里克有不断谈论和思考的习惯,能够吸引其他科学家一起探讨问题。沃森是噬菌体遗传学家,对遗传物质的结构感兴趣;克里克不仅了解X射线结晶学, 还有研究蛋白质分子结构的经验,也对基因的结构与生物学功能很感兴趣。他们的共同之处是都对研究生物学大分子的结构感兴趣。
沃森和克里克都阅读过物理学家薛定谔(E. Schrodinger, 1887-1961)的著作《生命是什么》。在该书中薛定谔的重要思想是:生命物质的运动必然服从于已知的物理学定律。遗传和变异的实质性问题是信息传递,即信息如何被编码?从一代细胞到另一代细胞,其传递是如何保持稳定的?偶然的变异究竟如何产生?他预测:必定有一种由同分异构的连续体构成的非周期性晶体,其中含有相当大数量的排列组合,从而构成遗传密码的稿本。他在书中还提出——对遗传物质的正确认识不可能直接通过物理学来获得,只能 “在生理学和遗传学指导下”通过生物化学的进展而获得。
沃森和克里克共同的志趣使他们决定研究DNA的结构(当时,赫尔希和蔡斯还未进行DNA是遗传物质的判决性实验),并且打算设计一种模型来解释DNA的“自身催化” 和“异催化”的功能。
(一)沃森和克里克开始研究时所掌握的基本资料
英国生物物理学家威尔金斯(M. Wilkins, 1916—)及其同事富兰克林(R E Frank­lin, 1920-1958)等,用X射线衍射方法(一种在原子水平上间接观测晶体物质的分子结构的方法)获得DNA晶体结构的资料:DNA结构的螺旋周期性(DNA分子由许多亚单位的堆积层组成,这些亚单位具有规则的螺旋状几何形状,每3.4X10-10m重复一次)、碱基的空间取向等;DNA分子是长链的多聚体,其直径保持恒定不变。这方面的资料对沃森 和克里克构建DNA双螺旋结构模型起了关键性作用。

在20世纪30年代早期DNA的化学组成就已经确定:它由4种亚单位组成,即由两种嘌呤碱基和两种嘧啶碱基连接着糖和磷酸基形成4种核苷酸。
当时人们已经知道,每一个核苷酸的糖基团以化学方式与另一个核苷酸的磷酸连接在一起,形成糖一一磷酸骨架,这个骨架决定了 DNA分子的长度。
(二)建立DNA双螺旋结构模型需要思考的问题及思路
DNA分子中核苷酸排列方式,应该能解释DNA分子结构的规则性及其化学稳定性, 还要能解释DNA分子自身的准确复制。这意味着,不仅要确定DNA的各个部分在几何上有哪些可能的排列,尤其重要的,是要确定在已知原子间和分子间,是何种作用力将DNA的各个部分聚合到一起的。糖一磷酸骨架是由共价键这种强作用力聚合到一起的, 这种连接方式是分子中原子之间常见的化学连接方式。但是X射线衍射资料表明,每一个DNA分子似乎由若干条(2条,3条,或更多)携带着嘌呤或嘧啶碱基的糖一磷酸骨架组成。这些链是如何聚合的?一种可能是,若干条核苷酸链由相同碱基(比如腺嘌呤与腺嘌呤,胞嘧啶与胞嘧啶)或者相同类型碱基(比如嘌呤与嘌呤,嘧啶与嘧啶)之间的弱吸引力(氢键或范德华力)连接在一起;另一种可能是不同的碱基之间相互吸引,比如嘌呤吸引嘧啶;还有一种可能就是,一个糖一磷酸骨架的某些部分吸引另一个糖一磷酸骨架的某些部分,或者是同一条链上的不同碱基之间互相吸引,但这样的话,糖一磷酸骨架本身就会造成弯曲和折叠。
1951年,有三个因素影响了沃森和克里克的思路。一是与剑桥大学年轻的数学家约翰·格里菲斯(John Griffith)的偶然相遇。格里菲斯也对一些生物学问题比较感兴趣, 他答应帮助沃森和克里克计算DNA分子之间相同碱基之间的吸引力(弱相互吸引)。克里克认为DNA分子之间是通过相同碱基吸引的,即在复制时是A与A配对,B与B配 对。但是,格里菲斯通过计算后认为,从理论上考虑,不是相同碱基之间的互相吸引,而是不同碱基之间的互相吸引。克里克并没有不知所措,因为他立即看到了另一种可能性, 即互补配对,A与B配对,B与A配对,这样就可以很好地解释复制了。然而根据这个发现仍然不能说明DNA分子的三维性质。
第二个因素是,沃森和克里克后来在剑桥大学与从奥地利流亡来的生物化学家埃尔温·查哥夫的相遇。1949〜1951年,查哥夫应用紫外分光光度法结合纸层析等技术,对不同来源的DNA进行了碱基定量分析,得出了组成DNA的四种碱基的比例关系。从中可发现碱基组成具有下列共同规律:①以摩尔含量表示,不同来源的DNA都存在着这种关系,即[A] = [T]和[C] = [G];②不同物种的组织的DNA在总的碱基组成上有很大的变化,表现在A+T/G+C比值的不同,但同种生物的不同组织的DNA碱基组成相同;③嘌呤碱基的总和与嘧啶碱基的总和相等。这些发现不仅为DNA能携带遗传信息的论点提供了依据,而且为确定DNA结构模型中的碱基配对原则奠定了基础。查哥夫的工作纠正了1921年莱文提出的关于核酸组成的“四核苷酸”假说。1952年6月,查哥夫在剑桥访问并与沃森和克里克相识。在交谈中,克里克想到数学家约翰·格里菲斯和查哥夫所说的配对竟然一样。克里克终于认识到不同类型的碱基配对可能是DNA分子结构的基础。这个认识极为重要,因为它揭示出DNA分子如何被维系在一起,以及如何复制自己。然而,这时还不明了 DNA分子由几条链组成,或者链与链之间的空间关系如何。
第三个因素来自莱纳斯·鲍林对于蛋白质a螺旋的研究,重要的并不是这项研究的内容,而是这项研究中所采用的方法。鲍林的理论发表于1950年,该理论认为,大多数已知蛋白质中的多肽链,由于氨基酸之间氢键的作用,会自动卷曲成螺旋状,就像床垫上的弹簧一样。鲍林提供了一个独特的查看分子维度的物理方法,即先根据理论上的考虑建立模型,再用X射线衍射结果来检验模型。沃森和克里克采用了这种方法,他们建立了一大堆嘌呤碱基和嘧啶碱基模型,以确定什么样的维度和排列才能既符合形成氢键的要求, 又符合查哥夫的碱基组成规律。经过证明,这种方法非常有效,因为沃森和克里克利用这 种方法提出了多种可供选择的模型。他们将这些模型与X射线衍射图像做对比和检验, 看一看是否能够发现某些相关性。
1952年冬天,沃森和克里克建立DNA模型的可供选择方案已经缩减到两链或三链 (不是单链)分子,这种链的碱基朝内、糖一磷酸骨架朝外,或者碱基朝外、糖一磷酸骨架朝内。1953年2月,沃森造访了威尔金斯,从威尔金斯那里看到的X射线致密图像根本就无法排除双股模型的可能性。而且他还了解到,富兰克林在一年以前就认为糖一磷酸骨架一定位于外侧,近期的衍射研究完全证明了这一点。然而,沃森最初想把糖一磷酸骨架放置在分子的内侧,因为只要碱基放置在外侧,其微弱的化学相互作用就可以忽略不计;新的情况表明,碱基可能在内侧,但这样就会带来如何将两条或更多条链上参差不齐的碱基序列组装在一起的棘手问题。在2月中旬,沃森和克里克还没有看到解决这个问题 的希望。
有机分子通常以几种构型中的一种形式存在,这主要取决于各种环境条件(如PH)。沃森和克里克最初在用厚纸板建构的分子模型进行研究时,只假定了嘌呤碱基和嘧啶碱基几种可能构型中的一种。他们用了几种方法试图使分子链上的碱基结合在一起,但都没有成功。于是,他们便去请教同一个办公室的美国化学家杰里·多诺休(J・Donohue, 1920—)。多诺休告诉沃森和克里克,他们一直使用的是错误的碱基分子构型。当多诺休提出了正确的碱基分子构型时,他们突然感到茅塞顿开。克里克描述过这个使人豁然开朗的时刻:杰里和吉姆(即沃森)在黑板旁,我在书桌旁,我们突然想到“噢,对了,也许 我们可以用碱基配对来解释的比例。这似乎恰当得难以令人置信。于是,在这一时刻(2月20日,星期五)我们三个都想到应该将碱基放在一起,并用氢键结合。”
在请教多诺休之前,由于采取了错误的碱基构型,沃森和克里克一直难以想到氢键, 这是因为按照错误分子构型来推理,空间距离使得氢键不易在分子之间形成。采纳了新的碱基构型后,氢键的形成便显得完全可能了。然而,还存在一个问题:“哪两种碱基之间键合?” 一天,当沃森正在摆弄放在桌子上的厚纸板模型时,他注意到,由两个氢键连接的腺嘌呤和胸腺嘧啶的配对与胞嘧啶和鸟嘌呤的配对具有同样的分子形状和直径。利用这种配对方案既可以说明DNA分子直径的稳定性,又可以说明查哥夫所报道的1 :1碱基比例。沃森和克里克花了将近一个星期的时间,专门建造以腺嘌呤一胸腺嘧啶、胞嘧啶一
鸟嘌呤为碱基配对方案的模型。他们力图表明,X射线所显示的每一个大的旋转角都能以此得到解释。经过多种设计尝试后,他们构建成功了 DNA结构模型。沃森和克里克用一 些已有的结果来检验他们的模型,非常吻合。
沃森和克里克构建的DNA模型,于1953年4月在《自然》杂志的一篇短文中公布于世。这个模型包括两个彼此缠绕的螺旋体,像是一个螺旋楼梯,阶梯由配对的碱基构成,糖一磷酸骨架在外侧;模型中的两条链彼此互补,不管腺嘌呤在一条链的什么地方出现,在另一条链的相应位置出现的必然是胸腺嘧啶(通过氢键相连)。后来鲍林修改了这 个模型中的一个具体的错误,即鸟嘌呤与胞嘧啶之间是三个氢键相连,而不是两个氢键相连。

这个模型出色地说明了遗传物质在遗传、生化和结构方面的主要特征。在生物化学和结构层次上,解释了双螺旋特有的X射线数据:DNA分子具有固定的直径,碱基的堆积具有规律性,以及嘌呤碱基与嘧啶碱基的比例是1:1等。在生物学的角度上,它解释了自身催化或DNA分子的复制,可以通过每条链作为其配对物的模板来进行,也就是说, 当两条链分开时,每条链都形成它的互补链,结果,原来的一个DNA分子成为两个完整的DNA分子。所以,DNA是遗传信息的载体,亲代DNA必须以自身分子为模板准确复制成两个拷贝,并分配到两个子细胞中去,完成其遗传信息载体的使命。DNA的双链结构对于维持遗传物质的稳定性和复制的准确性都是极为重要的。对它的结构的阐明,使长期以来神秘的基因成为了真实的分子实体,这是分子遗传学诞生的标志。
(三)DNA双螺旋结构模型的判决性实验
沃森和克里克在DNA双螺旋模型发表一个月后,又在另一篇论文中提到了 DNA分子的遗传特性。他们设想DNA分子中的碱基顺序具有携带遗传信息的特性,复制时DNA的两条链断开,每条链都可以作为模板,合成新的DNA分子。他们的设想引起了很大的反响,许多人都被吸引到这一研究领域。
1956年,美国生物学家科恩伯格(A・Kornberg,生于1918年)进行了DNA复制的离体实验,并发现了催化DNA合成的DNA多聚酶。1959年,他因此获得诺贝尔生理学或医学奖。
1958年,鲍林的研究生梅塞尔森(M・Meselson, 1930—)和斯塔尔(F・W・ Stahl, 1927-)等人,利用氮标记手段,证实了 DNA分子的互补性和复制的半保留性。这个实验成了沃森和克里克DNA双螺旋模型的判决性实验。他们的实验过程大致如下。
(1)     先将大肠杆菌放入15NH4CI为唯一氮源的培养液中生长若干代,使大肠杆菌的DNA都被放射性同位素所标记。然后,将15N标记的大肠杆菌转入14NH4CI为唯一氮源的培养液中生长。待第一代细胞分裂完成(细胞数增加一倍)和第二代细胞分裂完成 后,分别将大肠杆菌中的DNA分离出来,做密度梯度超速离心和分析。
根据DNA双螺旋结构可以推测,被标记的亲代双链DNA (记作15N/15N) 密度较大,离心后形成的一条带应分布于离心管的下部;未被标记的双链DNA (记作14N/14N)密度较小,离心后形成的一条带应分布于离心管的上部;而只有一条链被标记的双链DNA (其中一条链为15N,另一条链为14N,记作15N/14N),密度和分布应介 15N/15N和14N/14N 两者之间。
(3)实验中发现,被标记的亲代DNA离心后只有一条带,正好分布于离心管的下部;繁殖后第一代大肠杆菌的DNA离心后只有一条带,正好分布于离心管的中部;经繁殖后的第二代大肠杆菌的DNA离心后出现了两条带,一条分布于离心管的中部,另一 条分布于离心管的上部。这就证明了 DNA的复制是以亲代的一条DNA链为模板,按照碱基互补的原则,合成另一条具有互补碱基的新链,复制完成的子代DNA双链与亲代 DNA双链完全相同,因此,细胞中DNA的复制被称为半保留复制。
链接:DNA简史:遗传物质的发现之旅

    本站是提供个人知识管理的网络存储空间,所有内容均由用户发布,不代表本站观点。请注意甄别内容中的联系方式、诱导购买等信息,谨防诈骗。如发现有害或侵权内容,请点击一键举报。
    转藏 分享 献花(0

    0条评论

    发表

    请遵守用户 评论公约

    类似文章 更多