冠状病毒基因组结构和相关蛋白研究进展

冠状病毒是属于尼多病毒目（Nidovirales）单股 正链 RNA 病毒，感染多种哺乳动物和鸟类物种。 常引起消化道和呼吸道疾病，有时可导致临床疾 病爆发流行，例如在2003年爆发严重急性呼吸道 综合征冠状病毒（SARS-CoV）。为更好地预防高致 病性冠状病毒出现，需要加深对冠状病毒生物学 特性解和研究。

1 冠状病毒分类

冠状病毒家族根据形态、基因组结构和基因 表达情况分为两个亚科，即冠状病毒亚科（Corona⁃ virinae）和凸隆病毒亚科（Torovirinae）。在遗传和 血清学特性基础上，Coronavirinae亚科又被划分成三个新属，即α、β 和 γ 冠状病毒属[2]。最近，又命 名一个新的 δ 冠状病毒属[3]。每个属再根据 pp1ab 复制酶结构域不同划分成不同物种。α 冠状病毒1 群包括猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猫的肠道冠 状病毒（FECV）、猫传染性腹膜炎病毒（FIPV）和犬 冠状病毒（CCoV）。α冠状病毒2群主要包括鼬肠道 冠状病毒（FRECV）、鼬全身冠状病毒（FRSCV）、 水貂冠状病毒（MCOV）、人类冠状病毒229E（HCoV- 229E）、人类冠状病毒 NL63（HCoV-NL63）、猪流 行 性 腹 泻 病 毒（PEDV）和 菊 头 蝙 蝠 冠 状 HKU2 （RH-BatCoV HKU2）。β 冠状病毒是分型比较复杂 一个属，现在分为4个亚群（A、B、C和D）。A群 包括人类冠状病毒OC43（HCoV-OC43）、牛冠状病毒（BCoV）、猪凝血脑脊髓炎病毒（PHEV）、人冠状 病毒 HKU1（HCoV-HKU1）、鼠肝炎病毒（MHV）和 马冠状病毒（ECoV）；B 群包括人 SARS 冠状病毒 （SARS- CoV）和 菊 头 蝙 蝠 SARS 冠 状 病 毒 HKU3 （SARSr-Rh-BatCoV HKU3）；C群有扁颅蝠属冠状 病毒HKU4（Ty-BatCoV-HKU4）和伏翼属冠状病毒 HKU5（Pi-BatCoV-HKU5）；D群有果蝠属冠状病毒 HKU9（Ro-BatCoV-HKU9）。γ 冠状病毒属包括鸡 传染性支气管炎病毒（IBV）、火鸡冠状病毒（Tu⁃ coV）、白鲸冠状病毒（BWCoV SW1）。δ冠状病毒属 包括白头翁冠状病毒 HKU11（BuCoV HKU11）、画 眉冠状病毒 HKU12（ThCoV HKU12）和文鸟冠状病 毒HKU13（MunCoV HKU13）。

 2 冠状病毒基因组结构特点

冠状病毒是最大单股正链 RNA 病毒（25-31 kb），其基因组基本模式是包含至少6个开放阅读 框（Open reading frame, ORF），5'和3'非编码区（Un⁃ translated region, UTR）位于两侧[4]。各种冠状病毒 依据基因组结构的不同分成不同群，α冠状病毒具 有相似基因组结构，转录调控序列（Transcription regulating sequence, TRS）均为 CUAAAC，ORF 1ab 编码 16 个非结构蛋白（Nonstructural protein, NSP）， 具有两个木瓜蛋白酶位点，其中α-A 群病毒在 3' 端具有非结构蛋白NSP7或NSP7a/7b，而α-B群病 毒PEDV则缺少这个基因。α-B群病毒是 α 属病毒 中除α-A群病毒之外冠状病毒，其各个成员之间并 不具备相似基因组结构。研究证实，FCoV-Ⅰ是经 典猫冠状病毒，CCoV-Ⅱa 是经典犬冠状病毒， FCoV-Ⅱ型则一部分基因与CCoV-Ⅱa同源，包括 pp1ab 3'端一部分至 E 基因。CCoV-Ⅰ型 S 基因与 FCoV- Ⅰ 同 源 ， 并 具 有 一 个 独 特 序 列 ORF3， CCoV-Ⅱb型S基因5'端与TGEV进行重组[5]，并且 α冠状病毒可以感染不同种蝙蝠，表现出进化的多 样性。全基因组序列系统发育分析表明，蝙蝠可 能是所有冠状病毒起源的宿主。

β 属冠状病毒结构相对复杂，β-A群具有两个 木瓜蛋白酶位点，都具有特殊基因：血凝素酯酶 （Hemagglutinin-esterase, HE）和NSP3（HCoV-HKU1 只有HE）。而B群中其他病毒则只有1个木瓜蛋白 酶位点，并且在 M 和 N 基因之间都含有几个小开 放阅读框（Open reading frames, ORFs），只有果蝠属冠状病毒 HKU9 在 N 基因后有两个下游基因 NSP7a/7b[8]。Beta-A 群冠状病毒 TRS 是 CUAAAC， Beta冠状病毒属其他病毒为ACGAAC[9]。2012年在 荷兰分离出一株新结构类型HCoV-EMC/2012，与 其亲缘关系最近的是蝙蝠冠状病毒 HKU4（BtCoV HKU4）和蝙蝠冠状病毒 HKU5（BtCoV HKU5），是 第6个感染人冠状病毒，也是第一个β-C群病毒。

γ群冠状病毒，γ-A 亚群中 IBV 和 TucoV 具有 相似的基因组结构，γ-A 为 5'-UTR-POL-S-3A- 3B-E-M-5A-5B-N-3' UTR，TRS为CUUAACAA都 缺少NSP7。近年也分离到一些特殊结构基因型的 IBV[11]，最新研究表明火鸡冠状病毒可能完全是 Gamma冠状病毒（IBV）重组产生[12]。γ-B群白鲸γ冠 状病毒 SW1 具有冠状病毒最大基因组（31.86 kb）， 在M和N基因之间含有8个ORFs序列。

 δ群冠状病毒是已知最小基因组冠状病毒 （25.421-26.674 kb），包括鸟类3个亲缘关系较近的 病毒[3]，基因组结构与其他冠状病毒类似，特征性 基因顺序是：5'-UTR-ORF1ab-S-E-M-N-3'UTR。 这些冠状病毒毒株是SW1远亲，并发现其与亚洲 豹猫冠状病毒（ALCv）有较近亲缘关系[14]。

3 冠状病毒基因组功能研究进展

3.1 转录调控序列

5' UTR 与病毒复制有关，不同株冠状病毒 5' UTR 序列相对保守，具有真核细胞中启动子活 性。三个主要冠状病毒组5' UTR的140 bp包含3个 主要颈环结构，SL1，SL2和SL4。SL1热力学稳定 性很低，SARS- CoV 的 5'UTR 启动域包含茎环 （Stem-loop domains）SL1 和 SL2，SL1 对 MHV 的复 制是非常重要的，同时并不是很保守，存在一定的 不匹配和凸起[15]。SL2在所有冠状病毒是保守，并 有一个序列特征一致U形转弯式构象，是冠状病毒 次基因组RNA形成关键[16]。在一些冠状病毒SL3构 成其核心转录调控序列（L-TRS）。所有冠状病毒均 具有长发夹形SL4，SL4包含两个碱基配对区SL4A 和 SL4B， SL4 可 能 的 作 用 是 分 隔 SL1、 SL2 和 TRS，并参与引导亚基因组 RNA 合成，一系列试 验表明单独缺失SL4A或SL4B对病毒可行，而删除 全部 SL4 对病毒的复制是致命的[17]。SL5 存在于α 和 β 冠状病毒，反映冠状病毒的遗传进化关系,特 点是存在一个大的顺序插入能力与保守5'-UUYC⁃GU-3'循环序列并形成发夹结构。

3'UTR结构已被广泛研究，在 β属MHV和BCoV 都具有相似突起茎环（Bulged stem-loop, BSL）、假 结（Pseudoknot, PK）[19]和一个与毒力相关高变区 （Hypervariable region, HVR）， 在 MHV HVR 对 于 RNA合成不是必要，但是影响其发病。

3.2 复制酶基因

ORF1 位于病毒基因组 5'端编码病毒复制酶， 包括ORF1a和ORF1b分别编码两个多聚蛋白（Poly⁃ protein），即pp1a（486 ku）和pp1b（790 ku）[20]，这两 个蛋白裂解产生 15 或 16 个非结构蛋白（NSP1- NSP16），ORF1a 编码 NSP1-NSP11，ORF1b 编码 NSP12-16[21]。

NSP1主要功能是诱导宿主mRNA 降解，转录 抑制，细胞周期阻滞，SARS-CoV）NSP1是宿主基 因表达的强效抑制剂，具有独特作用方式：它绑 定到 40S 核糖体使其翻译功能失活，并诱导宿主 mRNA降解。NSP1诱导RNA模板裂解表现在RNA 裂解位点特定碱基序列并没有明显偏好。SARSCoVm的RNA，其结构类似宿主mRNA，这使其不 容易受到NSP1介导的RNA裂解作用，同时抑制宿 主先天免疫功能，包括在被感染细胞I型干扰素表 达 ， 这 些 提 示 SARS- CoV 的 NSP1 最 有 可 能 在 SARS-CoV致病过程中起着至关重要作用。

NSP2不在病毒复制过程中发挥作用，而是参 与改变宿主细胞环境。可能参与在SARS冠状病毒 感染宿主细胞中与抑制素蛋白1（PHB1）和PHB2相 互作用，并导致细胞内信号中断，发挥拮抗干扰 素信号作用，并且在病毒粒子中也能检测到NSP 2, 3, 8的存在。

Coronavirus 和 Torovirus NSP3 序列根据功能构 造和系统发育三个方面进行比对后绘制详细功能 结构域，有16个组成结构。SARS冠状病毒木瓜 样蛋白酶（PLP），从事和拮抗IFN诱导和NF-κB信 号转导通路。PLP阻止这些影响重要信号蛋白在各 通路激活，IRF3 和 NF-κB 途径。PLP 泛素样结构 域对于拮抗作用是必要，α和 β群NSP3具有ADP- 核糖结合活性（gamma群不具活性），抑制α/β干扰 素，RNA结合和去泛素活性。

NSP4被证明是一个重要蛋白质，NSP4、NSP6 具有 DMV 形成功能，并在冠状病毒复制阶段早 期发挥作用[31]。包含四个预测跨膜区域（TM 1、2、3、4），对于病毒复制复合物在细胞膜上形成和功 能维持是必不可少，在冠状病毒感染细胞中其定 位于内质网并诱导形成双膜囊泡（DMV）。

 NSP5 是主要蛋白酶 3CL-蛋白酶（3CLpro 或 MPRO），相对比较保守，可以切割复制酶polyprot⁃ eins 1A 和 1AB（pp1a 和 pp1ab）使之裂解为 12 个蛋 白质（NSP5-NSP16）。NSP6是一种6次跨膜的膜 蛋白，可以激活细胞自噬，诱导ER穿孔。 NSP7- NSP10蛋白共定位于复制复合物，这些 蛋白质每个确切功能是未知，可能参与病毒 RNA 合成，NSP8具有引物酶活性，在NSP12 RdRp进 行 RNA 复制或转录时发挥作用。NSP9，NSP10 具有部分复制酶活性，NSP9形成二聚体，对于病 毒大量快速复制必不可少。NSP11 具体功能未知， NSP13 发挥解旋酶作用，NSP14 具有 3'~5'核 糖核酸外切活性, NSP14介导校对机制阐明对于理 解 RNA 病毒演变有重要意义。NSP15 主要功能是 内切酶活性，NSP16 是RNA帽子结构（2' O-methy⁃ transferase）。

3.3 结构蛋白

冠状病毒其余病毒基因组合成包装病毒 RNA 核衣壳蛋白（N）、纤突糖蛋白（S）、跨膜蛋白（M） 和小膜蛋白（E）。β-B群冠状病毒还表达一个额外 结构蛋白，血凝素酯酶（HE）。 3.3.1 S蛋白

冠状病毒S蛋白参与病毒与细胞受体结合、介 导病毒与宿主膜融合。同时，S蛋白主要负责诱导 宿主免疫反应和病毒中和抗体。S蛋白还决定病毒 组织嗜性。有研究证明冠状病毒 S1亚基都有一个 共同进化起源。此外，宿主细胞受体血管紧张素 转换酶（ACE-2）和氨基肽酶N（APN），也被确定与 S 蛋白结合发挥受体功能，S 蛋白 N-末端至少有 3个区域是受体结合域。冠状病毒S蛋白除与主要 受体结合外，还存在着替代受体。并在病毒装配 和出芽中发挥作用[39]。

3.3.2 M蛋白 

冠状病毒M蛋白具有相同基本结构特征。蛋白 质含有 3 个跨膜域（TM）和 1 个保守结构域（CD）， 两侧短氨基末端糖基化域和羧基末端尾巴，位于 病毒粒子内部和外部，是病毒包膜重要组成成分 和病毒释放关键蛋白。除 TGEV 和 FIPV M 蛋白可 以出现在细胞膜外，其他冠状病毒 M 蛋白（包括SARS-CoV）均只表达在内质网和高尔基体，参与 病毒装配和出芽。其保守结构域对于病毒装配是 非常重要，主要通过M-M、M-S和M-N蛋白相互 作用，参与病毒复制装配和出芽。SARS-CoVM 蛋 白C端细胞质部分负责蛋白质结合控制。并可以抑 制I型干扰素生产。M蛋白Y195对于SARS-CoVSM相互作用在感染性病毒粒子装配时是必须。

3.3.3 N蛋白 

冠状病毒核衣壳蛋白（N蛋白）有一个结构性作 用，并参与RNA合成。核衣壳蛋白（N）在冠状病毒 RNA 合成中发挥重要作用，但其具体作用还不清 楚。多个调查显示，MHV 感染早期阶段或SARSCoV复制酶组件内共存N蛋白，在TGEV和SARSCoV 均发挥分子伴侣作用，N 蛋白与 NSP3 结合在 感染早期阶段有复制酶作用,并可以在病毒装配过 程中稳定M蛋白复合物。

3.3.4 E蛋白 

冠状病毒 E 蛋白，包含一个单一疏水结构域 （HD），并含有一个跨膜α -螺旋结构域（ETM），是 病毒粒子包膜组成成分。E 蛋白具有离子通道活 性，在发挥离子通道作用时，是形成五聚体高级 结构而发挥作用，冠状病毒E和M控制着病毒粒子 组装，研究证实E蛋白缺失突变株丧失致病力。

3.3.5 辅助蛋白 

不同种冠状病毒具有一套独特的病毒辅助蛋 白，即3A、3B、6、7A、7B、8A、8B和9B。这些蛋白在病毒感染过程中表达，但是对于病毒复制并非必须。 3A 蛋白是 SARS-CoV 最大辅助蛋白，也是病 毒粒子组成成分，其重组蛋白可以形成一个四聚 体蛋白离子通道，这可能会促进病毒释放功能。 并可以促进高尔基体膜重排和细胞死亡，可导致 内质网应激从而诱导1型干扰素下调。 IBV 3a和3b蛋白对于病毒复制为必须[44]。 3B蛋白是通过激活ERK和JNK通路介导，可以 抑制干扰素，上调AP-1转录活性，并具有RUNX1b 转录活性，SARS-CoV3B蛋白可以诱导G0/G1期阻 滞和细胞凋亡，抑制诱导型干扰素产生[45] 。 辅助蛋白6可以阻断I型干扰素信号，表明其 抑制先天免疫效应，并阻碍蛋白质进入细胞核， 抑制共转染表达结构和在泡状结构亚细胞器定 位，其N-端区域可能具有诱导膜重排和病毒复制两个功能。 7A 蛋白是一种 I 型跨膜蛋白，7A 通过半胱天 冬酶依赖途径诱导细胞凋亡，可以作为RNA抑制 剂，抑制细胞蛋白质合成，激活p38丝裂原活化蛋 白激酶（MAPK），抑制细胞周期进程在 G0/G1期， 7A蛋白与人类Ap4A水解酶相互作用，可能参与调 节细胞增殖、DNA 复制、RNA 加工、细胞凋亡和 DNA修复[47] 。 SARS-CoV9B蛋白扩散进入细胞核，经过主动 CRM1介导核质出口和核保留并触发细胞凋亡。

4 展 望

迄今为止，SARS-CoV三个重要蛋白组研究显 示，前两个蛋白质组，即多聚蛋白（pp1a/pp1ab）和 结构蛋白，所有冠状病毒都有同源相似之处。详 细分析显示其重要差异，但这些差异是否有助于 对于冠状病毒解认识仍有待进一步研究。而第三 组病毒蛋白，即位于S和N蛋白之间各群独特辅助 蛋白基因序列，在冠状病毒之间并没有相似性和 规律，对这些独特 ORF 特性解可以深入理解冠状 病毒与宿主相互作用及其与临床症状和病理变化 关系，更加深入地揭示其病理发生机制。