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基因表达检测:PCR引物设计

2020-04-10  无逐

引物设计流程:找到目的基因CDs序列的保守区域->用软件设计引物->用软件评价引物->Blast引物特异性

引物设计软件:OLIGO  序列比对软件:DANMAN

引物设计操作:

  • 找模板序列:NCBI ->Nuciotide ->CDs ->保存seq文件

  • 找CDs保守区域:DNAMAN-> Sequence-> Alignment->Multiple Sequence Alignment ->File打开seq文件 ->下一步*3,完成 ->取白底黑字序列保存或粘贴到OLIGOL里

  • 设计引物:OLIGO ->Change ->Current Oligo Length 修改引物长度 ->Tm框里搜索合适的引物,用Upper和Lower选定

  • 评价引物:Analyse ->PCR

  • 保存引物:Edit ->复制粘贴到excel表中

软件相关提示:

软件可能出现的一些提示及应对措施:

引物设计要点:

  • 引物长度:18-30碱基——Change改变引物的长度

  • 引物GC含量:40%-60%——选两条虚线间的碱基

  • Tm值:在72℃左右,上下游引物的Tm值保持一致——选择合适的位置,设置合适的引物长度,3'端的Tm比5'端低

  • 避免扩增模板的二级结构区域——选择合适位置的碱基

  • 避免引物的二级结构——选择合适位置的碱基

  • 避免与靶DNA错配,尤其是3'端

  • 注意产物长度,rtPCR的产物长度控制在300-500bp,如果找不到合适引物,标准可适当放宽。

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