【原】基因表达检测：PCR引物设计

引物设计流程：找到目的基因CDs序列的保守区域->用软件设计引物->用软件评价引物->Blast引物特异性

引物设计软件：OLIGO  序列比对软件：DANMAN

引物设计操作：

• 找模板序列：NCBI ->Nuciotide ->CDs ->保存seq文件

• 找CDs保守区域：DNAMAN-> Sequence-> Alignment->Multiple Sequence Alignment ->File打开seq文件 ->下一步*3，完成 ->取白底黑字序列保存或粘贴到OLIGOL里

• 设计引物：OLIGO ->Change ->Current Oligo Length 修改引物长度 ->Tm框里搜索合适的引物，用Upper和Lower选定

• 评价引物：Analyse ->PCR

• 保存引物：Edit ->复制粘贴到excel表中

软件相关提示：

软件可能出现的一些提示及应对措施：

引物设计要点：

• 引物长度：18-30碱基——Change改变引物的长度

• 引物GC含量：40%-60%——选两条虚线间的碱基

• Tm值：在72℃左右，上下游引物的Tm值保持一致——选择合适的位置，设置合适的引物长度，3'端的Tm比5'端低

• 避免扩增模板的二级结构区域——选择合适位置的碱基

• 避免引物的二级结构——选择合适位置的碱基

• 避免与靶DNA错配，尤其是3'端

• 注意产物长度，rtPCR的产物长度控制在300-500bp，如果找不到合适引物，标准可适当放宽。