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摘 要：目的 通过对清肺排毒汤功效和新型冠状病毒肺炎（COVID-19）病机的分析，基于计算机辅助药物设计（CADD）从多靶点结构出发系统探索清肺排毒汤排毒、抑制炎症风暴、利水渗湿3个方面的物质基础和分子机制。方法 TCMSP下载清肺排毒汤成分，基于血管紧张素转化酶II（ACE2）、白细胞介素-6受体（IL-6R）和水通道蛋白（AQP）分别进行分子对接虚拟筛选并对其结合模式进行分析。对利水药白术、茯苓、猪苓、泽泻进行反向靶点预测和GO分析和KEGG通路富集分析，预测其作用机制。结果 阻断病毒作用最突出的前3位药为甘草、麻黄、枳实，抑制炎症作用最突出的前3位药是甘草、柴胡、紫菀；清肺排毒汤4个子方中，小柴胡汤阻断病毒、抑制炎症风暴的潜在活性化合物数均排第1。槲皮素及其衍生物对ACE2和IL-6R 2个靶点的亲和力均具有较强结合能力，是潜在的双靶点活性化合物。ACE2的Lys 353残基是化合物与ACE2结合的关键位点。白术、茯苓、猪苓、泽泻缺乏阻断病毒、抑制炎症风暴的化合物，分子对接结果显示，这4味药材中含有的东莨菪内酯、去氢齿孔酸、α-D-半乳糖、环氧泽泻烯具有与水通道蛋白4（AQP4）的潜在结合能力。结论 清肺排毒汤可通过多种化合物分别与ACE2、IL-6R、AQP4结合发挥排毒、抑制炎症风暴、利水渗湿的作用；各组成子医方配伍合理，通过多点协同、优势互补发挥防治作用；得到了中药阻断新型冠状病毒成分关键的结合位点Lys 353，为清肺排毒汤药效机制的多角度挖掘和单体成分的现代化开发提供线索。 研究已证实新型冠状病毒（SARS-CoV-2）通过血管紧张素换酶II（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）进入人体细胞造成感染。因此，ACE2是抑制SARS-CoV-2感染的关键靶点[1]。SARS-CoV-2轻度感染患者出现发热、乏力、干咳等症状，严重者可出现呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），临床调查表明新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的严重程度与机体炎症反应的强度相关[2]。如患者体内出现过度的炎症反应，即“细胞因子风暴（cytokine storm）”，将可能导致严重的后果甚至死亡。细胞因子风暴在其他致病性冠状病毒感染疾病中也是导致多器官衰竭、预后不良的重要因素[3]。 白细胞介素-6（IL-6）是引发炎症风暴的关键细胞因子[4]，阻断IL-6与其受体的结合可以抑制炎性风暴，从而达到控制病情的效果。因此白细胞介素-6受体（IL-6R）是抑制炎症风暴的关键靶点。 清肺排毒汤是国家中医药管理局组织筛选得到的防治COVID-19的推荐方[5]，由汉代张仲景所著《伤寒杂病论》中多个治疗由寒邪引起的外感热病的经典方剂优化组合而成[6]，在临床上取得了显著疗效。据统计，截至2020年2月5日0时，4个试点省份运用清肺排毒汤救治COVID-19确诊病例214例，3 d为1个疗程，总有效率达90%以上，其中60%以上患者症状和影像学表现改善明显，30%患者症状平稳且无加重[7]。通过对清肺排毒汤功效和COVID-19病机的分析，清肺排毒汤治疗COVID-19应该体现在排毒、抑制炎症风暴、利水渗湿等方面。 本研究从ACE2和IL-6R 2个靶点结构出发，采用分子对接筛选研究，获得了清肺排毒汤“排毒”和“控制炎症风暴”的物质基础以及分子机制。然后依据结果，对清肺排毒汤子方之一的五苓散中白术、茯苓、猪苓、泽泻4味利水渗湿药通过反向对接和GO分析、KEGG分析方法进行了作用机制的探索，同时通过分子对接方法筛选了其成分与水通道蛋白4（aquaporins4，AQP4）的结合能力，初步得到了该方“利水渗湿”的物质基础和分子机制。 1 材料与方法 1.1 清肺排毒汤成分收集 在中药系统药理学分析平台[8]（TCMSP）（http:///），以“细辛”“桂枝”“生姜”“麻黄”“柴胡”“石膏”“射干”“黄芩”“紫菀”“半夏”“冬花”“陈皮”“枳实”“猪苓”“泽泻”“茯苓”“白术”“杏仁”“山药”“甘草”“藿香”为关键词检索清肺排毒汤化学成分。 1.2 蛋白晶体结构选择和处理 本研究选择ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白晶体结构（PDB：2AJF）[9]、IL-6R（PDB：1P9M）[10]作为虚拟筛选靶点结构。晶体结构获取自RCSD蛋白质数据库（www.rcsb.org）。根据SARS-CoV-2 S蛋白RBD与ACE2结合模式，选择热点残基Gln24、Thr 27、Lys 31、His 34、Glu 37、Asp 38、Tyr 41、 1.3 分子对接 使用Glide的标准精度方法（standardprecision，SP）进行分子对接。下载“1.2”项下所述蛋白结构并对其进行预处理。将“1.1”项下收集的小分子结构用LigPrep v2.3进行处理，运用MMFFs力场得到相应的低能构象。采用Epik28 v2.0以pH值7.0±2.0为条件分配电离状态并进行对接计算。 1.4 中药成分作用靶点反向预测 中药成分通过与特定靶点相结合调节生物功能，使药物发挥治疗疾病的作用。依据分子相似性原理，应用化学计量学方法，是化合物反向靶点预测的有效方法[11]。Swiss Target Prediction 是一款小分子作用靶点预测的在线分析软件，能够基于分子相似性原理预测小分子化合物的作用靶点[3]，本研究利用SwissTargetPrediction，预测白术、泽泻、猪苓、茯苓成分的作用靶点，并将概率值大于0.5的大分子作为该成分的潜在作用靶点。 1.5 中药-成分-靶点网络分析 本研究基于白术、泽泻、猪苓、茯苓成分潜在作 1.6 GO分析和KEGG通路富集分析 生物学信息注释数据库[12]（DAVID，https:// david.ncifcrf.gov/）为大规模的基因或蛋白富集工具，提供系统综合的生物功能注释信息，能够找出最显著富集的生物学注释。将白术、泽泻、茯苓、猪GO分析 2 结果 2.1 清肺排毒汤成分筛选 在TCMSP中共收集到清肺排毒汤中化合物 2 740个（表1）。需补充的是，复方当中石膏属矿物药，其起效机制不在本研究讨论范围，故未纳入。 2.2 排毒、抑制炎症风暴成分筛选 分子对接的打分结果见表2，本研究认为打分值≤−5的成分具有潜在的阻断活性，认为打分值≤−7的成分具较高的阻断活性。清肺排毒汤中各药味对ACE2打分值≤−5的化合物数量排名前5的中药为甘草、柴胡、麻黄、桂枝、黄芩，分别有168、88、85、61和51个成分具有潜在阻断活性，说明这些药味可能对SARS-CoV-2的感染过程更具针对性作用。而陈皮、白术、泽泻、猪苓与茯苓中打分值≤−5的化合物数量均小于20，初步说明这些中药对SARS-CoV-2感染过程直接阻断作用较弱。与IL-6R有较强作用的药味为甘草、柴胡、麻黄、枳实，其打分值≤−5的化合物数量分别为30、17、17、14，表明其具有较强的抑制炎症风暴作用。 2.3 清肺排毒汤子方和诸药对不同功效靶点的针对性分析 根据对排毒靶点ACE2和炎性风暴靶点IL-6R的对接结果分析（图1），清肺排毒汤的4个子方麻杏石甘汤、小柴胡汤、五苓散、射干麻黄汤及各药成分对不同靶点具有选择性和针对性。4个子方中，小柴胡汤针对2个靶点的潜在活性化合物数均排第1。表明小柴胡汤既防疫邪入里，又解表散热的双重功效形成组方时针对疫情病势剧猛，以麻杏石甘汤加射干麻黄汤中的紫菀、冬花、射干清肺排毒，缓解肺部症状[17]；以小柴胡汤调理气机，促进三焦通利，达到三方合而为治[18]。 五苓散排毒和炎性风暴抑制化合物主要集中于桂枝。该结果和五苓散的主要功效为温阳化气、利水渗湿高度一致[19]。方中桂枝辛甘化阳、扶正抵御邪气，猪苓、泽泻、茯苓、白术主要起到化饮之用，五苓散合方又控制桂枝发汗之峻；以五苓散加细辛温阳化饮，防止水饮凌肺[13]。对于单独药味而言，甘草、柴胡、黄芩中具有排毒及抑制炎症2个功效化合物数量之和位居前3。而柴胡中有4个单独作用于IL-6R而不与ACE2产生相互作用的化合物。现代药理学研究已证实，柴胡中的主要活性成分柴胡皂苷有强抗炎活性抑制促炎细胞因子[20]。余刘勤等[21]将柴胡皂苷的抗炎作用进行了总结，指出柴胡皂苷主要通过抑制核转录因子-κB（NF-κB）信号通路发挥抗炎作用。另外，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路、肝X受体-α（LXRα）信号通路和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路可能也参与了柴胡皂苷的抗炎过程。主要表现是显著抑制促炎细胞因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-6和IL-1β的表达，而且增强抗炎细胞因子转化生长因子-β1（TGF-β1）和IL-10的表达。 2.4 潜在病毒阻断活性成分与ACE2核心位点的相互作用 分子对接的打分值只能初步预测小分子与靶点是否具有相互作用，而化合物与药物靶点是否具有合理的结合模式是其是否会产生药效的关键[22]。因此本研究基于ACE2的核心位点及对接结果对结合模式进行了深入分析。根据对接结果，从符合Lipinski规则的化合物中选取打分值前100的化合物导入到Canvas进行层次聚类分析（hierarchical clusteranalysis），共得到6类，根据聚类结果和结构丰富性，共选取10个化合物用于结合模式分析。结构叠合结果显示所选化合物中有9个在同一区域与ACE2蛋白结合（图2-A），热点残基为His 34、Glu 37、Asp 38和Lys 353。 图2-B～G所示，选取其中6个典型化合物花旗松素（taxifolin）、槲皮素（quercetin）、3′-hydroxy- 4′-O-methylglabridin、雌三醇（estriol）、cis-lanceol、shionoside B_qt进行结合模式分析，6个化合物都垂直嵌入ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白的结合区域内，与结合区域内的氨基酸残基产生相互作用，表明结合能力强的成分有相似的构象。部分代表性潜在阻断成分的芳环、羟基氧原子或醚氧原子与ACE2蛋白的Lys 353形成较强的阳离子-π键、静电相互作用，说明Lys 353是ACE2识别化合物的关键位点。 在药物与靶点结合过程中，药效基团是否与关键位点产生相互作用是药物是否具有药效的关键，ACE2中的Lys 353残基在病毒S蛋白结合过程中相反，在大鼠ACE2中引入人Lys 353，会使其转化为一种高效的SARS-CoV-2受体[24]。同时，Asp 38通过中和Lys 353的电荷对S蛋白和ACE2结合界面的稳定了具有重要作用[9]，因此也是关键位点。潜在活性化合物与ACE2结合模式分析显示清肺排毒汤潜在活性成分与Lys 353和Asp 38 2个核心位点具有潜在的结合能力，这种相互作用会干扰ACE2 Tyr 41和S蛋白残基形成稳定的疏水性界面。花旗松素、槲皮素等化合物能与ACE2受体结合界面的关键残基产生相互作用，是有效的结合方式，产生阻断病毒入体活性的可能较大。通过进一步结合模式发现，花旗松素上的苯环与ACE2蛋白的残基His 34、Lys 353分别与形成了π-π堆积作用、阳离子-π键。槲皮素与Lys 353和Asp 38都有相互作用。 2.5 潜在炎性风暴阻断活性化合物与IL-6R相互作用分析 选取中打分值较高药味中的单体化学成分槲皮素、印度黄酮（euxanthone）、花旗松素、5,7- dihydroxy-3-(5-hydroxy-2,2-dimethyl-2H-1-benzopyran-6-yl)-4H-1-benzopyran-4-one、橙皮苷（hesperidin）、葛根素（puerarin）进行结合模式分析。如图3所示，残基Phe 229、Glu 163与6个化合物都形成较强的氢键相互作用，以图3-D为例，其母核结构的苯环与Try230、Phe 279形成π-π堆积作用，周围的极性残基Gln 281与离子型残基进一步稳定了化合物-蛋白结构。说明IL-6R活性口袋有很好的空间及电性的互补特征，易于与相应的化合物结合为稳定构象[25]。 2.6 代表性潜在高活性化合物分析 对2个靶点打分值排名前20的化合物进行统计，见表3，化合物归属分析显示具有潜在高活性阻断成分最多的药味为甘草，其具有4种潜在高活性病毒阻断成分。对数据进行整理发现，虽然槲皮素打分值并未位居前列，但其与ACE2核心位点Lys 353、Asp 38具有相互作用，且其在甘草、藿香、款冬花、麻黄等多个药味中都有分布。通过对化合物-ACE2相互作用模式分析发现，与蛋白结合力较好且具有一定口服生物利用度（OB）的化合物大都与槲皮素具有相似的骨架结构或者为槲皮素的衍生物。依据构效关系的原理及中药多成分起效的作用特点，推测清肺排毒汤组方中各药味相似成分可以增加起效浓度，达到药理活性所需的稳态浓度。结合现代药理学的研究基础，槲皮素类化合物应是阻断病毒的主要活性成分。 对IL-6R具有潜在抑制作用成分最多的药味为柴胡，具有6种潜在高活性炎症风暴阻断成分， 值得注意的是，槲皮素同时具有对ACE2和IL-6R的潜在活性，表明槲皮素类化合物含量较高的中药抑制炎症、阻断病毒入里的双重功能较为突出，本课题组在前期工作中通过微量热涌动实验（MST）对槲皮素与IL-6R的亲和力进行过测定， 2.7 利水药“利水渗湿”的分子机制 清肺排毒汤来源于中医经典方剂组合，包括麻杏石甘汤、射干麻黄汤、小柴胡汤和五苓散，四方皆出自《伤寒杂病论》。COVID-19以湿毒为病，首先犯肺，继而碍脾，甚则伤肾，湿性黏滞，阻碍气机，郁久化热[27-28]。清肺排毒汤在清肺排毒、宣通气机的基础上，以建运化湿为本，合方而治。本研究通过对IL-6R和ACE2探讨了清肺排毒汤排毒、抑制炎症风暴的物质基础以及分子机制，发现分子对接结果中缺乏这2个关键治疗靶点潜在活性化合物的4味药猪苓、茯苓、白术、泽泻皆具利水功效，同时注意到此4药同属五苓散，应该是清肺排毒汤利水渗湿的主要药味。结合COVID-19“湿邪”是共识的致病特征，鹿振辉等[29]指出，湿饮毒疫之邪随气运行流窜三焦，致上焦肺气无以宣降、中焦脾阳无以运化、下焦命门之火郁闭，病及三焦湿饮合而致病，强调了“利水化饮”的重要性，上述4味药中白术归脾肾，茯苓归心肺脾肾，泽泻、茯苓归肾膀胱，4味药共治三焦之水。对这4味药的作用靶点以及作用机制研究有助于推进对清肺排毒汤的进一步认识。首先依据OB＞30%筛选化合物，4味药共得到89个成分，并对其进行靶点预测，保留概率值≥0.5，得到35个潜在靶点。 依据白术、泽泻、茯苓、猪苓4味药的药物-成分-靶点关系，应用Cytoscape3.6.1生成药物-成分-靶点网络（图4）。该网络共包括113个节点，767条边。其中，4个绿色节点代表中药，35个蓝色节点代表潜在靶点，74个粉色节点代表潜在活性成分；靶点平均度值为13.5，大于平均度值的靶点有16个。度值排列前5的化合物分别为吖啶（akridin）、东莨菪内酯（scopoletol）、白术内酯I （atractylenolide I）、( /−)-异龙脑 [( /−)-isoborneol]、( )-莰烯[( )camphene]；度排列前5的靶点是androgenreceptor、HMG-CoAreductase、cytochromeP450 17A1、nitric oxidesynthase和LXR-alpha。 DAVID是大规模基因生物过程及通路富集在线分析工具，通过将研究基因导入DAVID可以方便地分析和获取基因对应的生物过程、生物功能和通路等信息。本研究将35个靶点基因名称导入DAVID数据库，进行GO分析和通路富集分析，富集结果见图5（P＜0.01），显示白术、泽泻、茯苓、猪苓可能通过兴奋性突触后电位（excitatorypostsynaptic potential）、一碳代谢过程（one-carbon metabolic process）、胆固醇生物合成（cholesterol biosynthetic process）等参与机体功能调节。 通路富集结果（P＜0.05）表明参与的通路包括谷氨酸能突触（glutamatergic synapse）、逆行性内源性大麻素信号（retrograde endocannabinoid signaling）等。分子生物功能富集结果表明这4味药的成分可调节多种离子通道的生物活性，包括细胞外谷氨酸门控离子通道活性（extracellular- glutamate-gated ion channel activity）、钙离子通道活性（calcium channel regulatoractivity）、锌离子通道（zincion binding）等。反映出白术、泽泻、茯苓、猪苓的成分可能通过离子通道活性的调节来改变细胞两侧的离子浓度，从而影响细胞对水的吸收过程。 中医理论中，关于“水”的概念内涵丰富，普遍认为“水”性湿寒、味淡、无色[30]，《素问·经脉别论篇》云：“饮入于胃，游溢精气，上输于脾，脾气散精，上归于肺，通调水道，下输膀胱”，解释了“水”的运行路线[30]，而这与现代科学中的糖分解代谢产生水和CO2的认识一致。AQP的发现及其研究使人们对“水”代谢的生理及病理过程有了更加深入的了解。现代研究表明利水渗湿中药主要作用于AQP2、AQP3、AQP4。张晓丹等[31]发现茯苓可通过上调结肠黏膜AQP3含量，加强结肠黏膜发现泽泻可显著降低大鼠肾脏髓质AQP2 mRNA的表达。刘洋等[33]发现五苓散能上调腹泻模型大鼠结肠AQP4蛋白及mRNA表达。尽管现代药理学研究对利水渗湿药利水的机制有了较为系统的研究，但是猪苓、茯苓、白术、泽泻“利水”的具体物质基础及分子机制尚不清楚。基于文献调研，30%、类药性（DL）≥0.15的化合物对AQP4进行了基于分子对接的虚拟筛选。 虚拟筛选结果显示，这4味药所含小分子中与AQP4对接打分结果较好分别是东莨菪内酯（scopoletin）、去氢齿孔酸（dehydroeburicoic acid）、α-D-半乳糖（alpha-D-galactose）、环氧泽泻烯（alismoxide）。对其相互作用进行分析（图6），4个化合物都与Trp 59附近的残基存在氢键以及静电作用力。以图6-A为例，东莨菪内酯与Asp69存在静电相互作用；其苯环上的羟基与Ser 55形成氢键相互作用。推测这4个化合物与Trp 59附近的氨基酸残基存在相互作用影响胞内外水的进出，发挥门控作用，对生理病理条件下AQP4蛋白功能的发挥可能具有一定的调节作用。 2.8 中药成分多点显效、协同增效分子机制分析 中药通常通过多成分协同起效，为了进一步探索方中化合物与同一靶点的协同作用机制，以ACE2分子对接打分值较高的潜在活性成分为例，根据分子对接结果进行了构象叠合分析。在考虑聚类及药味归属的基础上，根据打分值与Lipinski规则挑选了槲皮素、花旗松素、商陆素（ombuin）、
由图8可见，打分较高的4种化合物在结合部位具有相似的构象。槲皮素、花旗松素、商陆素为黄酮类化合物，具有相同的母核结构，氨基酸残基Tyr 440、Lys 390与黄酮母核B环上3、4位的羟基（商陆素为醚键）形成氢键。其B环都与残基His 34形成π-π堆积作用，此外槲皮素、花旗松素的B环与残基Lys 353之间形成阳离子-π键。雌三醇除与上述3个化合物具有不同的骨架结构之外，产生较强作用的残基也较少，如残基Lys353、His 34并未与其产生相互作用。这可能是雌三醇对接分数较其他3个化合物低的原因之一，再次体现了Lys 353的重要性。综合考虑4个化合物的结合模式以及在活性区域内与各氨基酸残基的相互作用。可以推断这4个化合物具有协同阻断病毒的作用。 3 讨论 自COVID-19爆发后，科学家们做了大量的研究，疫苗以及新药研发取得了较大进展，瑞德西韦等小分子药物已进入临床研究，但是新药研发的规律决定了抗SARS-CoV-2新药还需耐心等待。 中医药在此次抗击COVID-19的过程中起到了关键作用，包括清肺排毒汤、肺炎1号在内的很多复方能够明显改善轻型COVID-19患者的临床症状，有减少重型肺炎发生的趋势，具有较好的临床价值。尽管中医根据其辨证论治及系统的治则治法取得了良好的临床效果，但是所用中药的有效成分及作用机制的模糊限制了其现代化开发和国际化认可。计算机辅助药物设计能够帮助作者从疾病靶点的结构出发，筛选得到有针对性的药效物质及相互作用方式，得到有效小分子信息，可为复方的功效本质研究提供明确的现代科学证据，同时可对临床中复方的优化提供依据。 目前中药成分的分子对接和虚拟研究缺乏对成分-靶点相互作用模式的重视，而化合物结合模式分析是判断化合物有效性的重要参考，也是对化合物进行药物设计的基础。因此本研究格外重视对潜在活性化合物结合模式的分析，通过深入的结合模式分析发现中药化合物与ACE2结合的热点残基以Lys353为中心，而Lys 353是ACE2被SARS-CoV S蛋白识别的关键残基。Lys 353是进行单体成分选择和开发时需要重点关注的残基位点。 尽管目前对于清肺排毒汤已有多项网络药理学和分子对接研究，但是缺乏对多功效靶向成分筛选及组成该方的子方功能物质基础的对比性分析研究，限制了对该方系统性的认识。本研究在综合分析清肺排毒汤治疗原则及COVID-19疾病特征的基础上，从炎症风暴靶点IL-6R、病毒阻断靶点ACE2和AQP多个靶点的结构出发，采用计算机辅助药物设计联合靶点反向预测及通路分析的系统研究方法，初步阐明了清肺排毒汤排毒、抑制炎症风暴和利水化饮3方面的物质基础及分子机制，为该复方多环节系统治疗COVID-19进一步提供理论支持。 参考文献（略） 来 源：靳晓杰，关瑞宁，毛建军，王燕如，王 菲，李潮新，李佳蔚，刘东玲，张志明，刘永琦. 基于计算机辅助药物设计的清肺排毒汤多靶点系统治疗新型冠状病毒肺炎（COVID-19）物质基础探究 [J]. 中草药, 2020, 51(8):CNKI首发.
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