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研究人员通过注射两种不同的病毒载体来减缓小鼠的疾病进展，每种载体都包含一部分编码Cas9蛋白的DNA，以编辑致病基因。 上图：星形胶质细胞（蓝色）已渗透到脊髓内部，影响了肌萎缩性侧索硬化症（ALS）小鼠模型的神经元（黄色）。 在这项研究中，研究人员开发了一种向星形胶质细胞提供CRISPR碱基编辑系统（绿色）的方法，以禁用突变基因的表达并减轻症状。科林林（伊利诺伊大学） 碱基编辑器可以将一个核苷酸转换为另一核苷酸而没有双链DNA断裂，具有治疗由突变基因引起的疾病的潜力。 但是，一个缺点是，编码CRISPR基本编辑器的DNA很长，太长，无法容纳最常用于基因治疗的腺相关病毒（AAV）。 在1月13日发表于《分子疗法》上的一项研究中，研究人员将编码碱基编辑器的DNA分为两个AAV载体，并将它们注射到遗传性肌萎缩性侧索硬化症（ALS）的小鼠模型中。 该策略禁用了致病基因，改善了动物的症状并延长了寿命。 “我们希望能够制作适合AAV载体的基因编辑工具。 不幸的是，有些工具太大了，以至于无法放入其中，因此在这项研究中，他们能够通过使用裂解蛋白提出解决方案。” University of University的生物化学家David Segal说道。 加州的戴维斯没有参加这项工作。 “这不是第一次使用该系统，而是第一次将其应用于这种基础编辑器。” 伊利诺伊大学厄本那-香槟分校的生物工程师Pablo Perez-Pinera及其同事制定了一项策略，将基础编辑器分为两部分。 在2019年发表的一项研究中，他们生成了两个不同的AAV载体，每个载体都包含一部分腺嘌呤至胸腺嘧啶碱基编辑者的编码DNA。 它们还包括编码所谓的内含蛋白（inteins）的短序列，当它们在蛋白质中表达时，它们会粘在一起并自我切割，有点像RNA中的内含子。 研究人员将内含子构建到载体中，这样当两个载体产生的内含子二聚化时，将两个基本编辑器部分整合在一起，然后切除，它们留下了全长的功能性基本编辑器。 当佩雷斯·皮涅拉（Perez-Pinera）告诉伊利诺伊大学厄本那-香槟分校的生物工程师托马斯·盖伊（Thomas Gaj）时，盖伊告诉《科学家》杂志，他们立即着手在ALS小鼠模型中对其进行测试。 转基因小鼠具有约25个人类基因拷贝，即超氧化物歧化酶1（SOD1），其突变会引起人的ALS。 这些动物表现出运动神经元丧失和肌肉萎缩，加上它们的神经元平均在大约四个月大的死亡之前，会积聚内含物（包括SOD1蛋白的脊髓灰质和白质中的密集斑点）。 20％发生SOD1突变的ALS患者的症状和预期寿命因其具有的突变而异，但大多数患者具有肌肉无力和运动神经元死亡，以及包含SOD1蛋白的内含物。 研究人员没有使用腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基编辑器，而是使用化脓链球菌Cas9的编码序列和针对野生型和突变型人SOD1的引导RNA来创建早期终止密码子，开发了胞嘧啶-胸腺嘧啶转化器。 这不会影响鼠标SOD1。 在人类细胞中，分裂碱基编辑器似乎比全长转染时的效率更高，命中率约为29％，而全长编辑器为19％。 接下来，作者将他们的拆分基础编辑器打包到两个AAV主干中，并在两个月大时将它们或对照AAV注入动物的腰椎脑脊液中。 载体主要终止于星形胶质细胞以及神经元和小胶质细胞。 虽然研究人员在三个月左右没有发现症状发作的差异，但是接受基础编辑的小鼠保持了体重，并且比对照组活了约10％。 经治疗的小鼠还具有较少的SOD1阳性内含物和更健康的运动神经元。 在肌萎缩性侧索硬化症（ALS）小鼠模型的脊髓横截面中，研究人员向星形胶质细胞（红色）提供了一个CRISPR基础编辑系统（黄色），以禁用突变基因的表达并减轻症状。 科林林（伊利诺伊大学） Gaj在一封电子邮件中写道：“使用基础编辑器禁用星形胶质细胞（通常支持健康的神经系统功能，但SOD1-ALS会对细胞神经元产生毒性）的突变型SOD1基因，导致疾病进展显着放缓，” Gaj在一封电子邮件中写道 科学家。 “由于许多ALS患者是在症状发作后被诊断出的，因此能够显着减慢疾病速度的临床前策略尤其重要，应进一步研究。” “这很好地表明了碱基编辑实际上可以用于治疗ALS，”未参加这项工作的韦克森林医学院的基因疗法研究人员陆佰松说。 他告诫说，脱靶效应（碱基编辑器可以同时编辑DNA和RNA）以及AAV传递方法能持续多久，都需要更多的工作才能使这项技术对人们安全。 英国谢菲尔德大学的神经科学家Mimoun Azzouz说，双重AAV策略也可能很昂贵。 “考虑到该产品的临床开发和销售以及商业化，您需要制造两种病毒，并且需要评估这两种病毒的安全性，因此成本可能非常高。” 尽管面临挑战，但佩雷斯·皮涅拉（Perez-Pinera）在给《科学家》的一封电子邮件中写道，该策略显示了向人类翻译的希望。 他解释说，AAV已经被食品药品监督管理局批准用于基因治疗。 另外，使用该疾病的人性化模型（包含目标基因人类序列的小鼠）意味着，在小鼠模型中验证的方法可以翻译给人们，而无需使其适应不同的靶标。 由于SOD1突变而发展为ALS的人也拥有该基因的一个良好拷贝，就像小鼠一样，它们具有正常的小鼠拷贝。 “我们在疾病发作前不久就注射了动物模型。 尽管在其他研究中证明，尽早注射动物可以改善疾病的预后，但现实情况是，通常只有在患者出现症状后才能诊断出ALS。 我们的研究预测了治疗最近被诊断出患有该病的患者会带来什么期望。” Perez-Pinera写道。 Gaj承认：“在我们当前的研究结果可以使ALS患者受益之前，我们还有一段路要走。” 研究人员正在致力于最大程度地减少靶点效应，并研究可以提高疗效的新的给药方法。 “在我们开始考虑临床翻译之前，我们仍然需要回答许多重要问题和技术障碍。” 文献来源： C.K.W. Lim https://www./news-opinion/symptoms-in-als-mouse-model-improve-with-crispr-base-editing-67410  版权作品，未经PaperRSS书面授权，严禁转载，违者将被追究法律责任。 PaperRSS，关注生命科学，高校院所科研进展。 |
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