分享

“纠正实验”的那些事

 广州平淡 2020-04-23



常规基础凝血试验是诊断止凝血功能障碍性疾病、监测抗凝治疗的基础。凝血结果的评估需要与正常参考范围(normal reference range)或区间(interval)(NRR/NRI)进行比较。被标记为“异常”的结果(即,对于未接受抗凝治疗的患者,高于NRR/NRI),通常需要进一步评估,例如通过随访或复查实验(reflexive testing),以确定延长的原因,特别是在有临床背景(如出血)支持的情况下。“混合试验(mixing tests)”可能有助于确定后续试验的路径(即筛查因子缺乏或其他抑制物),也有助于狼疮抗凝物(LA)的检出。一般来说,“纠正”的混合试验结果倾向于提示因子的缺陷,而“不纠正”的混合试验结果则提示“抑制物”的存在。可以使用多种方法来识别纠正/不纠正,所有方法都有优点和局限性。


1

引   言


常规基础凝血试验主要用于(A)筛选止血缺陷(例如,有出血表现的患者,手术前筛查或作为随访调查的因子缺乏患者,评估DIC的可能性等),(B)监测抗凝治疗(例如,INR监测华法林,用APTT监测普通肝素),(C)评估未知病例的潜在抗凝状态(例如,紧急入院昏迷需要手术干预的患者)。表1列出主要常规凝血试验概述及其用途。

表1主要常规凝血试验概述及用途

注:包括DOAC在内的抗凝药的检测灵敏度受使用的试剂和仪器组合的影响,应由每个实验室确认。

缩写:DOACs,直接口服抗凝药;FDPs,纤维蛋白(原)降解产物;LA,狼疮抗凝物;MNPT,平均正常凝血酶原时间;ISI,国际敏感指数;VKAs,维生素K拮抗剂(如华法林)。

评估常规凝血试验的结果在NRI内的结果为“正常”,而高于NRI的结果为“延长”;因此,对于接受止凝血检查的患者,无论是作为“术前筛查”还是为了检查某些止血缺陷(例如,因子缺乏症),高于NRI的结果需要进一步评估,例如通过临床随访或立即进行复查实验。对于接受抗凝治疗监测的患者,预期结果将高于NRI,而结果应针对治疗范围(therapeutic range ,TR)进行评估,通常是NRI的1.5-3倍左右(例如INR为2.0-3.0;APTT约为正常值的1.5-2.5倍,或更具体地讲,APTT范围对应于0.3-0.7 U/mL的抗FXa水平)。因此对于此类抗凝患者,只有超过TR才被视为“异常”。

异常检测的跟进要视具体情况而定。对于接受抗凝治疗的患者,对高于TR的有患者应是在一段时间内停用抗凝药,或减少抗凝药剂量,以期在下一次试验中获得TR内的结果。对于没有接受抗凝治疗或不知道正在接受抗凝治疗的患者(例如,昏迷的紧急入院患者),异常的凝血试验结果通常需要进一步加以甄别;然而,由于这些患者可能会有临床上显著的缺陷(直到另有证明),因此实验室/患者护理员/临床医生通常有责任调查并解释这种异常结果。不同的实验室和临床医生对这种患者检测随访可能有不同的策略,如果当地法规环境和财政限制允许的话,进行系统复查实验(algorithmic reflex testing),包括混合试验提供了一种标准和符合逻辑的解决方案。潜在复查实验(potential reflex testing)的一个例子(结合混合试验)如图1所示。

图1 混合试验是研究异常凝血试验CT的algorithmic的一部分

有三种情况:仅延长PT,仅延长APTT,或PT和APTT都延长。混合试验使用延长CT的试验,并将患者血浆与正常血浆1:1混合。根据临床情况和临床判断,可能建议进行额外的检查。凝血酶时间(TT)对APTT异常者也有帮助(如果APTT延长是由于肝素、达比加群或纤维蛋白原缺乏,则TT应延长;此外,TT混合异常提示肝素或达比加群,而纠正的TT混合提示纤维蛋白原缺乏)。在每种情况下存在不同的可能性来解释延长的CT,混合试验CT结果有助于指导哪些进一步的试验可能是有用的。在PT和APTT都异常的情况下,混合试验通常会一致(即两者都纠正或两者都不纠正);但是,根据原始CT异常的原因和/或用于识别纠正的方法,一项试验可能纠正,而另一项不纠正。例如,如果PT试剂含有肝素中和剂,肝素略高于治疗范围可能会导致APTT严重异常和PT轻度延长。如果肝素水平稀释到PT试剂的肝素中和范围内,混合试验可能APTT是不纠正的结果,但PT是纠正的结果。

APTT,活化部分凝血活酶时间;PT,凝血酶原时间;LA,狼疮抗凝药;DIC,弥散性血管内凝血;DOAC,直接口服抗凝药;VK,维生素K;VKA,维生素K拮抗剂。


2

混合实验定义、用处及局限性


术语“混合试验”指的是对患者血浆和正常血浆(normal plasma pool,NPP)混合物进行的试验。理想的NPP将包括:(a)至少20个正常个体(最好是男女比例相等),以便得出每种凝血因子>80 U/dL;(b)所有单个血浆的血小板计数应<10×10*9/L;(c)NPP中无狼疮抗凝物(LA);(d)NPP可以冷冻或冻干,但商业来源应根据制造商说明储存。

当患者的常规凝血试验结果延长(或“异常”)时,应进行混合试验。混合试验通常以“立即混合”的方式进行,即试验血浆与正常血浆混合,然后立即重新试验。然而,对于某些情况需要特别考虑,特别是有FⅧ抑制物的情况下,需要“孵育混合”后再检测。

常规凝血实验结果正常,或者已明确病人正在接受抗凝治疗时,进行混合实验无任何价值。前者,通过将正常血浆与患者样本混合不能获得额外信息-结果仍然将保持正常。在已知的抗凝治疗的情况下,通常不会通过将正常血浆与由于治疗而延长的患者试验样本混合而获得额外的信息,用于治疗的抗凝治疗的结果是可预测的(用VKA治疗结果可以纠正;用直接口服抗凝药(DOAC)和其他抗凝药,如肝素等不纠正)。然而,患者被怀疑正在服用抗凝药,但具体的治疗方法尚不清楚时,可能会有例外。在这种情况下,混合试验可能会成为鉴别诊断策略的一部分,以识别应优先启动哪些后续特定检验指标(例如,图1),包狼疮抗凝物的具体研究。

混合试验可以使用患者+正常血浆的不同比例混合物,但通常使用1:1(或50:50;即等体积)的混合物。患者+正常血浆的混合物接受与最初异常患者试验结果相同的试验(图1)。这里的基本原理是,如果存在因子缺陷,混合物应该会产生正常的试验结果。这是因为在正常人群中预计会有正常的试验结果,每个因子的因子水平可能在50-200 U/dL左右,因此,假设正常血浆平均含有约100 U/dL的所有凝血因子,则将该正常血浆与完全缺乏凝血因子的血浆(甚至血清)混合仍将提供每种凝血因子的合成最小值为50 U/dL的血浆混合物,因此理论上足以产生正常的检测结果。然而,当存在单因子缺陷而不是多因子缺陷时,混合试验效果最好,因此,当存在多因子缺陷时,错误的不纠正结果可能性增加。最常见的例子是PT混合试验,它可能不能完全纠正肝功能障碍、DIC和维生素K缺乏,这些都是获得性多个因子水平减低的常见原因。上述情况可能会有受额外的多种混杂因素影响,例如,血清中含有可能干扰凝血的纤维蛋白(原)降解产物(FDPs)。

相反,存在某些“因子抑制物”(包括大多数治疗性抗凝药或LA),监测血浆混合物不会产生正常的凝血试验结果,因为该抑制物可以抑制正常血浆以及患者血浆。一般来说,有抑制物患者的混合血浆检测结果接近正常和患者检测结果的平均值。自然地,由于测定的不精确性,由于并非所有抑制物都能反映1型动力学,因此并非所有试验混合物都能提供完全代表预期的理想试验结果。尽管如此,上述情况通常可以解释为:(a)NPP与异常试验血浆(TP)的混合物结果正常通常提示患者血浆中存在因子缺陷,而(b)混合试验仍是异常结果通常表明存在因子抑制物(可能包括抗凝物)。需要明确区分的一些警告包括:(i)用于混合试验的正常血浆的来源和质量-应是经过验证的(pool)血浆,该血浆可以为各个凝血因子提供约100 U/dL的水平;(ii)一些抑制物(尤其是FⅧ)是时间和温度依赖性的,仅在孵育混合试验中显示出抑制作用;(iii)解释纠正的方法;(iv)混合会产生稀释作用;因此,1:1的混合物有可能掩盖温和(mild)的抑制物。见表2

表2    纠正试验-基本原则、优点与局限性总结

缩写:APTT,活化部分凝血活酶时间;DOAC,直接口服抗凝药;NRI,正常参考间隔;PT,凝血酶原时间;LA,狼疮抗凝物;RVVT,罗素毒液时间;TT,凝血酶时间;VKA,维生素 K 拮抗剂(如华法林)。

3

混合实验的解读


实际上,有几种方法可以将混合试验解释为“已纠正”(因子缺乏)或“未纠正”(因子抑制物)。

3.1 NRI方法的混合试验结果

一种常用的方法是确定试验/正常混合物是否在NRI范围内的试验结果,在这种情况下,即为“纠正”。这是CLSI指南对LA的研究建议的选项,并且通常也很容易用于混合试验。事实上,这是实验室在制定常规凝血试验自动验证的复杂规则时决定采用的方法。主要优点是该方法易于应用和验证,并且不需要制定需要其他验证的替代方法或临界值。所有方法共有的主要缺点是,它不能100%区分“因子缺陷”与“因子抑制物”。这种方法的主要失败之处是“异常”患者PT或APTT试验结果刚好高于NRI。这里可能的结果是,无论患者血浆中是否含有因子缺陷或抑制物,任何混合物结果都在NRI范围内,并且由于前者的“真实”纠正,而后者的“错误”纠正仅仅是由于抑制物的稀释。这就是为什么使用这种方法的实验室通常不进行混合试验,除非PT或APTT略延长(例如,PT为2秒,APTT为5秒)。 

3.2 循环抗凝物指数(ICA)
另一种常用的方法是循环抗凝物指数(ICA),也称为“罗斯纳指数”(Rosner Index),以该方法的倡导者命名,最初是为LA研究而开发的。ICA的识别公式为:ICA = [((1:1混合CT-NPP CT)/患者CT] x 100,其中CT =被测物的凝固时间,NPP=正常混合血浆。计算并不复杂,可以内置到实验室信息系统(LIS)、中介软件或仪器中,然后根据给定的目标值进行解释。所有方法共有的主要缺点是不能100%区分“因子缺陷”与“因子抑制物”。另一个缺点是实验室还需要建立区分因子缺乏与抑制物(或LA)的临界值,并进行一些额外的验证。通常,截止值范围为10-15%。

3.3 百分比修正法
“百分比纠正法”,有时也称为Chang法,以该方法的倡导者的名字命名,反映另一种常用的方法。百分比纠正值由以下公式标识:%纠正=[患者CT-1:1混合CT)/(患者CT-NPP CT)]x100,其中CT为再次试验的凝固时间,NPP是正常血浆。与ICA一样,计算并不复杂,可以构建到LIS/中介软件/仪器中,然后根据给定的目标值进行解释。所有方法都有的相同的主要缺点 (不能100%区分“因子缺陷”和“因子抑制物”)。与ICA一样,另一个缺点是需要建立因子缺乏与抑制物(或LA)的分界值,并且还需要执行一些额外的验证。一般来说,分界值的范围在65-80%之间。

3.4.其他方法

某些实验室使用混合物的CT值在NPP结果的10%到15%(取决于初始延长值)之内来识别“纠正”,而高于此值的任何值为“不纠正”。但是,这样的主观方法更难以标准化、纳入规则和算法。对于LA筛查,有时会使用试验结果的比率来确定临界值。例如,通常将比率1.2应用于识别是否不存在LA(值<1.2)或存在LA(值≥1.2)。本质上,这中方法类似于使用20%的值进行纠正。

4

需要特殊考虑的狼疮抗凝物(LA)


LA是诊断抗磷脂综合征(APS)的实验室指标,也可以在其他病理状态下出现。图2显示了使用混合试验(包括试验顺序)或不使用混合试验来筛查LA的不同方法的一些示例。

图2 狼疮抗凝物(LA)可能的不同研究方法。
(A)如ISTH SSC LA指南所建议的那样,经典方法将促进混合试验的使用,并将其置于研究途径的早期。(B)另一种方法,例如在CLSI LA指南中所考虑的另一种方法可能会将混合试验放在稍后位置。(C)在综合试验方面,第三种方法甚至可以在不进行混合试验的情况下识别或排除LA(例如,使用使用SCT筛查和SCT确认的Werfen ACL硅胶凝血时间(SCT)试验法)。根据CLSI LA指南提出的综合试验的另一种解释,将改为采用内置的混合方法(例如,Diagnostia Stago StaClot LA-六角形时相法)。由于LA通过抑制磷脂而延长凝血时间,因此在低磷脂浓度下进行LA筛选试验,以加强LA的检测,而在高磷脂浓度下进行LA确认试验,以证明当过量磷脂克服LA抑制时,凝血时间缩短至正常。

APTT,活化部分凝血活酶时间;DOAC,直接口服抗凝物;LR-APTT,狼疮反应性APTT;NPP,正常池血浆;PL,磷脂;NRI,正常参考间隔;RI,参考间隔;RVVT,罗素毒液时间;SCT,二氧化硅凝血时间

5

抗凝药-额外考虑事项

如前所述,混合试验本身对已知使用抗凝药物的患者的效用有限,但如果抗凝药物未知,可能会产生一些好处。预期的抗凝试验模式,无论是对常规凝血试验的影响(表3),还是包括混合试验在内的PT和APTT的预期模式(表3),都可以帮助指导患者在抗凝状态未知的情况下进行随访。因此,每一种抗凝药在试验模式方面都有独特的“特征”;因此,根据该表给出特定检测结果模式的患者样本,可以据此推断为使用了某种抗凝药,然后可以通过特定的检测予以确认。

表3   各种情况下的常规测试结果和纠正试验的预期模式a

缩写:APTT,活化部分凝血活酶时间;PT,凝血酶原时间;NRI,正常参考区间;TT,凝血酶时间;VKA,维生素K拮抗剂。

a某些检测可能会延长,也可能不会延长,这取决于特定的检测试剂和药物浓度


6

依赖时间和温度的抑制物应特别考虑

如前所述,混合试验通常作为立即混合试验进行,这意味着将患者血浆与NPP混合,然后立即进行试验。止血中的大多数抑制物,包括凝血因子的抑制物,都立即起作用,并表现出1型动力学。这意味着,当含有这些抑制物的试验血浆与正常血浆等体积稀释后,约50%的抑制效果仍然明显,因此,试验混合物的CT约为试验血浆与NPP的一半。但是,某些抑制物,特别是针对FⅧ的抑制物,是时间和温度依赖性的,这意味着抑制作用不是立即显现的,只有在适当温度和时间下才能完全表达。当然,高滴度FⅧ抑制物可能即刻产生抑制作用。因此,当对此类样品进行即时混合试验时,混合物可能显示“错误”纠正,因为抑制物尚不能抑制NPP中的凝血因子。如果存在FⅧ(或其他时间和温度)抑制物,或认为可能,则混合试验需要在37℃(标准1-2小时)下孵育,以充分表达抑制物,并在混合试验中显示“不纠正”。这类似于使用Bethesda或Nijmegen分析的因子抑制物研究,其中标准孵育2小时。在实践中,这种情况不会造成太大问题,因为临床患者的病史应始终指导患者的随访。此外,复查实验(reflex testing)的结果也将提供有用的指导。因此,如果该患者是已知的血友病患者,因此是自身抗体的候选对象,或者是出血的非血友病患者,因此是同种抗体的候选对象,则应做定时孵育试验进行鉴别诊断。如果FⅧ低,则可以考虑产生了FⅧ抑制物。定时孵育混合试验对于那些无法进行因子分析的实验室可能有用。另外,一些实验室在Ⅷ因子较低时进行混合孵育研究,以确定是否需要Bethesda测定法来定量Ⅷ因子抑制物。



7

结  论

总而言之,混合试验可以正确识别大多数异常止凝血结果的可能原因,帮助实验室研究延长(“异常”)的CT,区分“异常”是否由因子缺陷与抑制物导致,从而有助于进一步指导实验室和临床医生进行后续试验。另外,所有方法都有优点和缺点,需要谨慎解释相关的结果。表3和图1提供了有关预期模式和建议的后续试验的一些指导。在实验室中实施之前,所有试验过程(包括混合试验)都需要进行验证或确认。


参考文献:
1.Am J Hematol. 2020;95:117–128.
2.Res Pract Thromb Haemost. 2019;3:695–703.

编辑发送:大树

配图:海南风光

    本站是提供个人知识管理的网络存储空间,所有内容均由用户发布,不代表本站观点。请注意甄别内容中的联系方式、诱导购买等信息,谨防诈骗。如发现有害或侵权内容,请点击一键举报。
    转藏 分享 献花(0

    0条评论

    发表

    请遵守用户 评论公约

    类似文章 更多