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新型冠状病毒核酸和特异性抗体检测结果分析与解读 文/李东良 《新型冠状病毒肺炎诊疗方案（试行第七版）》推荐疑似病例疑似病例同时具备以下病原学或血清学证据之一者可以确诊为新型冠状病毒肺炎。即：⑴实时荧光RT-PCR检测2019-nCoV核酸阳性；⑵病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；⑶血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和工gG抗体阳性；血清新型冠状病毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高。由于2019-nCoV是一个新出现的病毒，核酸检测技术和血清免疫学检测技术都是新建立起来的诊断技术，均不可避免地存在一定缺陷。因此，《方案》推荐了二者联合检测。提高了疑似患者的确诊率。本文结合自己的学习和应用体会对联合检测出现的一些常见模式试作解读。 核酸和特异性抗体的性质 核酸是病毒组成部分。一般病毒是蛋白质外壳包裹核酸物质的结构。病毒核酸分为DNA和RNA，每一种病毒只有一种核酸也就是说要么是DNA要么是RNA，不可能含有两种核酸。DNA病毒又分为双链DNA病毒和单链DNA病毒，RNA病毒也分为单链RNA病毒和双链RNA病毒。有些RNA病毒是逆转录病毒，即遗传物质复制是RNA到DNA再到RNA。不同的病毒核酸复制方式不同，新型冠状病毒为RNA病毒。 抗体(antibody)是一种由浆细胞(效应B细胞)分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。按理化性质和生物学功能，可将其分为IgM、IgG、IgA、IgE、IgD五类。其中与病毒学应答关系比较密切的是IgM和IgG。由于抗体在免疫应答过程中发挥的作用不同，出现的时期和持续的时间也有所不同。 IgM抗体在与抗原结合后启动补体的级联反应，把入侵者（病原微生物）相互连接起来，聚成一堆便于巨噬细胞的吞噬，这个过程发生在病毒感染早期，因此，IgM抗体是免疫应答中最早分泌的抗体。可以作为病毒感染初期（急性期）的诊断标志。 IgG抗体主要作用是激活补体，中和多种毒素，是免疫记忆细胞分泌的主要抗体。IgG分子量小（是唯一能在母亲妊娠期穿过胎盘的抗体），持续的时间长。病毒等微生物感染后刺激机体产生的IgG抗体可以长期存在。 核酸和特异性抗体的检测方法 1、病毒核酸检测 病毒核酸检测的原理就是通过细胞裂解液，让病毒的RNA裸露出来，然后用实时荧光RT-PCR进行检测。检测原理最关键的是利用引物和探针来实现核酸序列的“靶向匹配”，即寻找新冠病毒约3万个碱基中区别于其他病毒的核酸序列（与其他病毒核酸相似度“低”的区域），设计引物和探针。因为引物和探针与新冠病毒核酸特定区域高度匹配，即特异性很强，一但待检标本PCR扩增结果为阳性，则证明该标本中存在新冠病毒。 2、病毒特异性抗体检测 目前临床中常用的抗体血清学检测方法有3 种。 （1）酶联免疫吸附试验（ELISA） 是将抗原或抗体包被在固相载体表面，利用酶标记的抗体或抗原结合待检物，并根据酶催化底物产生的有色产物颜色深浅及有无进行分析的一种定性或半定量检测方法。该检测方法灵敏度较高，载体标准化难度较低，但检测速度慢、易污染、步骤较为繁琐。 （2）化学发光免疫分析法 化学发光免疫分析法是将高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、抗体、激素等检测。该法灵敏度高于ELISA，具有特异性高、线性范围宽、结果稳定、操作简化等特点，广泛应用于临床标本的检测。 （3）胶体金免疫层析法：胶体金免疫层析法（GICA）是以胶体金为示踪标志物，应用于抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术，无需特殊处理标本，仅需一滴血即可在15 min 内通过肉眼观察获取检测结果。该方法突破了现有检测技术对人员、场所的限制，缩短检测时间，操作方便快速，在基层医疗单位及现场检测中广泛使用。 核酸和抗体的诊断价值与缺陷 1、核酸的诊断价值与缺陷 新冠病毒核酸检测（RT-PCR方法）是确诊感染的“金标准”之一，这个“金标准”是指“阳性”结果而言，即扩增阳性可以作为确诊新冠肺炎的依据。但另一方面，如果检测结果为“阴性”，不能作为判断患者未被感染的标准。这是核酸检测最大的缺陷。主要原因一是2019-nCoV核酸检测技术的灵敏度还有待提高，有时会出现假阴性的情况。二是目前临床上多以采集咽拭子和鼻拭子的上呼吸道分泌物为主，取材质量必然会影响到检测的可靠性，三是患者就诊和检测的时机，病毒感染后受机体免疫应答反应的影响，大部分患者随着病程的延长，病毒载量也在逐渐下降，当降低到PCR最低检测下限，就难以检出。因此，核酸检测的优点是“特异性强”，缺点是“灵敏度低”。 2、抗体的诊断价值与缺陷 从机体对病原体的体液免疫应答来看，病原体的特定蛋白如 2019-nCoV 的 S 蛋白和 N 蛋白等会刺激免疫系统引起抗体应答，最早出现的抗体是 IgM 及其后的 IgA 抗体，然后是 IgG 抗体，从急性感染的一般过程，当 IgG 抗体出现后，浓度会持续增高，IgM 则持续降低，直至消失，IgG 抗体会较长时间存在。因此，特异 IgM 和 IgG 抗体是一对出现有序，此消彼长的一个关系。所以，正确地利用及观察 IgM/IgG 的动态变化（图1），有助于在病毒核酸检测这个临床诊断「金标准」失效后（因病程、标本采集等所致的假阴性）的 2019-nCoV 感染的诊断。IgM/IgG检测的缺点是其不是病毒本身，而是通过病毒免疫应答过程中产生的免疫反应物质“抗体”来间接反应病毒的感染过程的。因此，会受到一些干扰因素的影响产生假阳性。概况起来特异 IgM 和 IgG 免疫测定假阳性通常主要有以下两个方面的原因，一是试剂盒阳性判断值（Cut-off value）的设定，一些处于阳性判断值附近的弱阳性结果，很可能是假阳性；其二是患者标本中存在导致免疫测定假阳性的内源性或外源性干扰物质。因此，动态观察非常重要。 核酸与抗体联合检测结果解读 核酸与抗体联合检测可提高诊断效率，当联合检测结果出现以下情况时，需要综合分析判断进行结果解读。 1、核酸检测阳性时，抗体检测出现阴性或阳性结果 核酸阳性，IgM和IgG均为阴性，患者可能处于2019-nCoV感染「窗口期」：「窗口期」是指从人体感染病毒后到外周血中能够检测出病毒抗体的这段时间，一般为2周。这段时间内无法检测血液中的病毒抗体，因此，IgM和IgG均为阴性。此时处于感染早期，病毒不断复制，核酸载量呈指数递增，达到核酸检测下限，核酸检测呈阳性。核酸检测较血清抗体检测的优势在于缩短了感染检出窗口期，可及早发现感染者。 2、核酸阳性，IgM阳性、IgG阴性 患者可能处于2019-nCoV感染早期，机体免疫应答最早产生抗体IgM，暂未产生IgG或IgG含量未达到诊断试剂的检测下限。 3、 核酸阳性，IgM阴性、IgG阳性 患者可能处于2019-nCoV感染中晚期或复发感染。病毒刚入侵人体之时，免疫系统首先会产生临时性抗体IgM，大约1个月后达峰值，随着时间的推移，侵入人体的病毒逐渐被IgM中和，IgM逐渐减少，直至低于检测下限；同时，人体免疫系统会产生持久性抗体IgG，在感染中晚期，IgG为机体免疫的主力军，浓度高，能够被检测到。恢复期IgG较急性期增加4倍及以上时，可诊断为复发感染。 4 核酸阳性，IgM阳性、IgG阳性 患者处于感染活跃期，但人体已对2019-nCoV产生一定免疫能力（持久性抗体IgG已产生）。 5.核酸阴性，IgM阳性、IgG阴性 IgM阳性提示极大可能处于2019-nCoV感染急性期，此时需考虑核酸检测结果存疑。需要反复取样复查。 6. 核酸阴性，IgM阴性、IgG阳性 提示患者可能既往感染2019-nCoV，但已恢复或体内病毒被清除，免疫应答产生的IgG维持时间长，仍存在于血液中而被检测到。 7.核酸阴性，IgM弱阳性、IgG阴性 提示患者初次感染载量极低的2019-nCoV并处于早期，病毒载量低于核酸检测下限，机体产生少量IgM，尚未产生IgG；或由于患者自身类风湿因子阳性等引起的IgM假阳性。需要在一周后复查动态观察。根据IgM和IgG的变化规律诊断。 8、核酸阴性，IgM阳性、IgG阳性 患者近期曾感染2019-nCoV并处于恢复期，体内病毒被清除，IgM尚未减低至检测下限；或核酸检测结果假阴性，患者处于感染活跃期。 综上所述，在COVID-19的不同疾病进展阶段，核酸和抗体检测的效率不尽相同，两者协同使用，可取长补短，提高诊断效率，监测疾病进展。而正确解读联合检测结果，可提高2019-nCoV的快速诊断和鉴别诊断能力，更好地了解病毒载量和疾病进展，指导临床诊疗工作。 |
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