揭示DNA序列变异和表型差异之间的功能性关联的是人类遗传学的核心课题之一，也是诊断和治疗遗传病的关键性基础。随着全基因组测序技术的广泛应用，研究者对于具有潜在生理性及病理性重要影响的人类DNA序列变异的搜寻范围也在不断扩大。以全基因组关联分析研究（GWAS）为代表的统计分析研究发掘出了海量的具有统计显著意义的非编码序列变异，但却无法做到像对基因编码区域变异那样的对所涉及之生物学机制的准确预测和鉴定。相比于直接改变蛋白质序列的非同义突变所造成之功能性后果的明确和强效，非编码区域的序列变异可能导致的增强子-启动子接触抑制、转录因子结合扰动、染色质开放性变化及邻近表观修饰改变等功能性后果则极为繁杂且不确定极高。传统上对非编码序列的体内生物学功能进行鉴定的方法主要依赖于外源已编辑序列的随机整合（random integration），但这种策略往往受到基因表达位置效应（position effect）的严重干扰，导致结果的可重复性较低。2020年3月12日，来自美国劳伦斯伯克利国家实验室（Lawrence Berkeley National Laboratory）的Len A. Pennacchio、Diane E. Dickel和Axel Visel在Cell发表了题为Comprehensive In Vivo Interrogation Reveals Phenotypic Impact of Human Enhancer Variants的文章，报道了一种基于CRISPR-Cas9靶向编辑系统的高效转基因小鼠模型，用于鉴定非编码序列变异的功能学后果及导致的体内表型变化。在这项课题中，作者以一种研究较为充分的人类基因增强子——极性活性区调控序列（zone of polarizing activity regulatory sequence, ZRS）为范例，详细展示了基于CRISPR-Cas9的enSERT小鼠转基因系统enSERT（enhancer insertion）在鉴定增强子活性和相应表型变动上的实用性。ZRS是一种肢体特异的激活音猬因子（sonic hedgehog, Shh）基因表达的增强子，对正常肢体发育具有极为关键的作用。迄今为止，已有21种单核苷酸变异被发现可能改变人类ZRS的活性，使得Shh异位过表达，从而导致多指症的发生。为了验证这些在多指症患者的临床检查中发现的ZRS序列变异与其病症之间是否具有因果关联，作者分别将单核苷酸编辑后的ZRS序列通过enSERT系统与LacZ报告基因经由CRISPR-Cas9共同特异性地整合至小鼠受精卵的相应基因组位点上，然后通过胚胎肢端LacZ的染色深浅和位置判断ZRS的激活程度和激活模式。结果发现，其中15种单核苷酸变异均能导致ZRS在肢芽前缘的异位过度激活，表明这些突变的确具有导致肢端发育异常尤其是多指症的潜力。接下来，为了进一步确证上述序列变异能够直接导致多指症的发生，作者选择了其中7个具有异位激活Shh表达的变异，利用CRISPR-Cas9系统直接对小鼠ZRS序列对应位点进行编辑，形成敲入模型（knock-in model）。结果发现，其中5个序列变异都能够直接导致小鼠胚胎形成额外的手指。这无疑展示了enSERT系统在快速筛选鉴定可能导致重要生理病理表型的非编码序列变异上的独特优势。最后，为了体现enSERT系统在预测和识别未知序列变异的功能学后果上的强大能力，作者对整个ZRS序列做了系统性的随机编辑和体内整合，共包含17个40碱基随机同突变和43个16碱基同突变。通过基于LacZ的染色分析对ZRS活性进行鉴定，作者发现40碱基同突变有高达82%的几率使得ZRS完全失活，而在剩余18%的案例中，ZRS活性也受到显著抑制。由于其可能存在由突变压力陡增导致的过度抑制效应，作者认为16碱基同突变的结果或许更有现实意义。的确，在这一组结果中，仅有26%的突变导致ZRS失活，44%的导致活性降低，而有23%的ZRS活性维持不变；最为有趣的是，在剩余7%的案例中甚至发生了ZRS的活性增强。这一结果暗示了即使在ZRS这一已经得到广泛研究的增强子序列中，仍然存在部分可能导致多指症发生的序列变异尚未得到识别和鉴定。而enSERT系统在这一应用方向中，无疑便是可以用作初步筛选的一件利器。
