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MDx 2020精彩预告 近年分子诊断在体外诊断细分板块中以破军之势一路走高，加之2019年末疫情公卫事件的爆发，更是将核酸检测/分子诊断带向市场风口与焦点所在。由此，已经成功举办五届的MDx2020第六届中国先进分子诊断技术与应用论坛将于8月6-7日在上海崭新上线。论坛将深度探讨分子诊断“病原检测+肿瘤诊断”两大潜力应用场景下，技术及产品的申报注册与评价验证、mNGS、PCR、液体活检等技术在病原检测中的开发挑战与应用、NGS下的大panel肿瘤检测产品的注册与评价、CRISPR检测等革命性前沿技术的实践突破对于行业的刺激与启示等分子诊断行业年度热门议题，与行业专家共探先锋技术开发与产品申报落地之路！ 共抗疫情 在中国疫情防控工作取得了明显成效的时候，境外疫情暴发增长态势却仍在持续，导致我国外防输入压力增大，国内防止疫情反弹的复杂性也在增加。为贯彻落实常态化疫情防控工作中“外防输入、内防反弹”的工作要求，进一步强化医疗机构感染防控的各项措施，最大限度降低院内感染，巩固来之不易的防控成果，国务院于5月1日发布了《关于落实常态化疫情防控要求进一步加强医疗机构感染防控工作的通知》，强调： 1.充分认识院内感染防控面临的严峻形势 2.严格落实发热门诊管理要求 3.加强患者收入院管理 4.强化新冠病毒核酸检测 5.严格落实标准预防 6.开展院内感染风险排查整顿 其中关于核酸检测能力方面强调“各地应当加强医疗机构实验室建设，对所有三级医院以及县医院开展建设，使其迅速达到新冠病毒核酸检测条件；对其他二级以上医院也应当同时加强建设，使其逐步达到新冠病毒核酸检测条件，根据疫情防控形势需要随时能够开展核酸检测工作。” 一般三级医院都拥有标准PCR实验室与具备核酸检测的能力。而此次对二级医院也提出同样要求，意味着二级医院也需要配备PCR实验室。根据国家卫健委公布的最新数据，截止2019年2月底我国三级医院2582所，二级医院9061所，一级医院10084所。由此可以预见全国各地将迎来PCR实验室建设的热潮。本文就PCR实验室设计、装修，相关仪器设备，人员配置及管理做了如下总结，供大家交流学习。 场地要求及实验室设计 场地要求一般参照以下文件： 《医疗机构管理条例》 《医疗机构临床实验室管理办法》 《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》 《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》 标准的PCR实验室一般分为四个区，一区为试剂准备区，二区为标本制备区，三区为PCR扩增区，四区为产物分析区。为避免交叉污染，进入各个工作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增反应混合物配制和扩增区→扩增产物分析区。各实验区之间的试剂及样品传递应通过传递窗进行。场地一般要求在80平米以上，此标准PCR实验室可开展包括新冠病毒在内的常规分子检测项目。而如今市面上绝大部分新冠病毒检测试剂盒是在荧光定量PCR平台上开发的，因此没有产物分析区也不会影响新冠病毒的检测，60-80平米的场地就能满足要求，但是其他如基于一代测序与基因芯片的检测项目就无法开展。大致设计如下图：  PCR实验室的场地限制条件较多，且因时间要求更为紧迫，部分医院可能连50平米的场地都无法提供，为了能尽快满足各医院的新冠病毒检测需求，一个非常紧凑的PCR实验室可以将空间设计在仅为35平米左右，但是其防污染能力较差，小编不推荐。 不管是几个区，可将PCR过程分成试剂准备、标本制备和PCR扩增检测三个独立组成。整个区域有一个整体缓冲走廊。每个独立实验区设置有缓冲区，同时各区通过气压调节，使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染并降低扩增产物对人员和环境的污染。 在三个实验区和三个缓冲区顶部以及传送窗内部安装有紫外灯，供消毒用。在试剂准备区和标本制备区还设置移动紫外线灯，对实验桌进行局部消毒。   试剂和标本通过机械连锁不锈钢（不建议使用电子连锁方式）传递窗传递，保证试剂和标本在传递过程中不受污染（人物分流）。 地面建议使用PVC卷材地面或自流坪地面，整体性好，便于进行清扫，耐腐蚀。没有条件的也可采用水磨石地面，或大块的瓷砖，瓷砖间接缝需要小于2mm。 PCR实验室空调通风系统设计及压力控制 PCR实验室并没有严格的净化要求，但是为避免各个实验区域间交叉污染的可能性，宜采用全送全排的气流组织形式。同时，要严格控制送、排风的比例以保证各实验区的压力要求。 1、试剂贮存和准备区 该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。 对与气流压力的控制，本区并没有严格的要求。 2、标本制备区 该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。 3、扩增反应混合物配制和扩增区 该区域主要进行的操作为DNA或cDNA扩增。此外，已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区) 的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区) 制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。 本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。 4、扩增产物分析区 该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测，此区域可不设。 本区是最主要的扩增产物污染来源，因此对本区的压力梯度的要求为：相对于邻近区域为负压，以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。 PCR实验室污染的预防与控制 PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中，常见的有以下几种污染类型：扩增产物的污染；天然基因组DNA的污染；试剂的污染以及标本间的污染。由于一旦发生污染，实验就必须停止，直到找到污染源为止，而且实验结果必须作废，需重新进行实验。所以发生污染后再围绕实验室来寻找污染源不但耗时而且繁琐，浪费人力物力。因此要避免污染，首先应是预防，而不是排除。 1、工作区域的严格划分 （1）各个实验区域设置合理； （2）各个实验区域要有明显的标记（如醒目的门牌或不同的地面颜色等），以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。 2、合理的系统设置 （1）合理的空调通风系统设置，尽量采用全送全排的空调系统； （2）严格的气流压力控制，保证不同的实验区内不同的压力要求。 3、规范的操作 （1）临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训，经培训合格后才能从事临床基因扩增检验的工作； （2）在实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换。此外，操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施； （3）清洁工作及时、正确。实验工作结束后，必须立即对本区进行清洁。除常规的消毒液体对表面进行擦拭消毒或紫外线灯的照射消毒外，对一些实验设备还应进行高压消毒处理。 4、严格的管理 （1）严格控制进出实验室的人员。与实验无关的人员不得随意进出实验室，有条件的情况下要设置独立的通道和进出整个实验区的门； （2）在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服（如不同颜色），当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域； （3）尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。 （4）扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源，废液不能在实验室中倾倒，必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉，用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理，如焚烧等； （5）扩增产物分析区可能会用到某些可致基因突变和有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。 5、完备的实验室配套设施 完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件，应根据各个实验室实验内容的不同配备相应的设备和仪器，如超净工作台、离心机、加样器等。 PCR实验室主要设备见下表 本表所列仪器为满足新冠病毒检测所需的最低配置，空调排风系统等不算在内。  PCR实验室质量控制 为实现高质量的检测结果，采取严格的实验室管理体系极为重要 根据实验室的具体情况制定和编写质量体系文件，《质量手册》、《程序文件》、《作业指导书》，并严格执行。 管理体系的特点是应有明确的目的、规范的管理、有效的制约、高效并自我调节的机制，具体要求如下： 建立完善的SOP文件，对完成各项质量活动的方法作出规定，每个SOP都应对一个或一组相互关系的活动进行描述。 每个SOP文件应说明该项质量各环节的输入、转换和输出所需的文件、物资、人员、记录以及它们与有关活动的接口关系。 明确每个环节转换过程中各项因素的要求，即由谁做、做什么、做到什么程序、达到什么要求，如何控制、形成什么记录和报告，以及相应的审批手续。 规定在质量活动中需要注意的例外或特殊情况的纠正措施。SOP应简练、明确和易懂并且工作人员熟练掌握和严格遵守。 尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源，废液必须经消毒液浸泡后在远离实验室的地方弃掉，用过的一次性材料也应经消毒液浸泡后统一处理。 用到某些有毒物质，应特别注意实验人员的安全防护。完备的实验室配套设施是保证实验工作的必要条件。 人员配置 为保障实验室的正常运行需要1名副高职称以上的检验技术人员，2名中级职称以上的检验技术人员，目前对新冠病毒检测能力需求迫切，但是一个高质量PCR实验室的建设也不是在朝夕之间能完成。 文章资料整理自： 检验星空、盾恩医学  |
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