数据解构 挑——差异表达miRNA筛选 本文首先通过GEO数据库筛选食管癌差异表达microRNAs（miRNAs）。作者选用了GSE114110和GSE43732两个数据集进行分析。值得一提的是，作者还利用R语言的limma包对数据集进行了标准化处理。作者设定的阈值为|log2FC|≥ 1和P < 0.05，由图E和F的火山图可以看出筛选出的差异表达miRNAs相比于平时我们筛选mRNA时是要相对少一些的。作者使用的是limma包进行的差异表达分析，使用GEO数据库的在线工具GEO2R也能达到同样的目的。筛选到差异基因后，作者使用R语言VennDiagram包制作韦恩图，使用网站Draw Venn Diagrams （http://bioinformatics.psb./webtools/Venn/）也可做出类似的图。最终筛选得到3个上调的和5个下调的miRNAs。 此外再提一句，在分析多个数据集时，可以将多个数据集的数据合并分析，但是必须得先去掉批次效应。如果不想去进行去批次的操作，可以像这篇文章这样采用取交集的方式，这样也算是有一定道理的。 联——miRNA靶基因预测 miRTarBase（http://mirtarbase.mbc./php/index.php）是一个经过实验验证的miRNA-靶基因相互作用数据库，作者利用这个数据库对8个差异表达的miRNA的靶基因进行了预测。3个上调的和5个下调的hub miRNAs总共分别预测出468和753个可能的靶基因。 除了miRTarBase网站外，常用的miRNA靶基因预测网站还有Targetscan、ENCORI、miRDB、miRWalk等。 圈——miRNA靶基因GO和KEGG富集分析   联——PPI网络分析得到hub基因，miRNA-hub基因互作网络构建 作者又使用STRING数据库对预测出468和753个可能的靶基因分别作了蛋白蛋白互作（PPI）分析，并进一步地利用Cytoscape软件筛选得到hub基因各10个。然后对这20个基因做了GO和KEGG富集分析。本文作者将GO分析的三大类：生物过程（BP）、分子功能（MF）、细胞组分（CC）分开展示，并对靶基因、hub基因分别做富集分析，因此得到的图比较多。  随后，作者利用Cytoscape软件构建miRNA-hub基因网络。由于miR-196a-5p和miR-1-3p所关联的hub基因最多，作者进一步地利用miRNACancerMAP数据库分析了miR-196a-5p和miR-1-3p所涉及的信号通路。  miRNACancerMAP（http://cis./miRNACancerMAP/）是一个可以预测、构建癌症miRNA调节网络的在线工具，只需点击网站上方的Quick Search，输入想要研究的miRNA，即可得到分析结果。   靠——miRNAs预后价值分析 随后，作者利用利用TCGA数据库、细胞系以及临床样本验证了miR-196a-5p和 miR-1-3p的表达情况。并利用基于TCGA数据的starBase数据库对miR-196a-5p和miR-1-3p进行Kaplan-Meier生存分析，以评估其预后价值。  干湿结合 到这里其实这篇文章已经可以发表了，但最新的Aging已经不收纯生信文章了，要发5分必须补湿实验。 干湿结合的参考组合有： 1、生信 临床标本验证 2、生信 功能表型验证（细胞或者细胞 动物均可） 3、生信 临床 功能表型验证 4、生信 临床 功能 机制研究 这篇文章运用的是“生信 临床 功能表型验证”组合，作者做了一点实验来验证miR-196a-5p和miR-1-3p对食管癌细胞增殖和迁移的影响。所用实验为CCK-8、EdU和Transwell等常规实验技术，比较简单。这里作者只是用了miRNAmimics做实验，其实还可增加使用miRNA inhibitors的实验。  总结 到此全文就结束了，总结一下，作者先用GEO数据库筛选得到食管癌差异表达miRNAs（挑），然后利用筛选得到的8条miRNAs预测靶基因（联），并对靶基因进行富集分析（圈）；进一步地在靶基因中筛选得到hub基因（联），并筛出两条与hub基因联系最多的miRNAs（联）；最后对这两条miRNAs进行生存分析，来说明临床意义（靠），其实本文还可增加临床相关性分析，ROC曲线等分析进一步丰富内容。此外，这篇文章还增加了一点湿实验的内容：利用细胞系和临床样本验证两条miRNA的表达情况（临床标本验证），并利用细胞实验验证其对食管癌细胞增殖迁移能力的影响（功能表型验证）。 整体来说，全文基本全部按照“挑、圈、联、靠”的生信套路来进行，所用技术以在线工具为主，适合初学者模仿。 最后再给大家归纳一下干湿结合研究套路模板（加粗的是本文所用的方法）： 干： 挑：差异表达分析筛选目的基因 圈：GO/KEGG富集分析、GSEA富集分析、WGCNA网络分析、其他特殊分析（miRNA相关通路预测、免疫浸润等等） 联：蛋白蛋白互作（PPI）分析、miRNA交互作用、分子网络构建 靠：生存分析、临床相关系分析、单因素/多因素分析、差异表达预后分析、ROC曲线 湿： 1、临床标本验证（包括细胞系和临床样本） 2、功能表型验证（细胞或者细胞 动物均可） 3、临床 功能表型验证 4、临床 功能 机制研究
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