ICE1-一个告诉你什么是科学的基因

Nature Plant 封面故事之十七 （2018年第11期）：Genetic colour code

绝大多数的橙子果实呈现浅黄色或者绿色。但是不同的柑橘具有不同的合成花青素的潜力，因此可以呈现不同的果实颜色。目前已知柑橘中的花青素是由Ruby2–Ruby1 基因簇负责合成。

ICE1是一个研究冷胁迫的人所必知的一个基因，因此关于它的近期2篇研究论文也是充满了传奇的一段历程。

研究背景

CBF类转录因子在低温锻炼过程中发挥至关重要的作用。CBFs基因在低温胁迫早期被快速诱导表达，激活下游冷响应COR基因的表达，但是在低温胁迫后期被关闭。

科学问题：

实现对CBF转录因子这一精细调控的分子机制并不清楚。

研究结论：

通过生物化学手段，发现BIN2蛋白激酶与CBFs基因上游转录因子ICE1互作并磷酸化ICE1，促进后者的降解，最终降低了CBFs基因的表达，表明BIN2对ICE1的磷酸化是CBFs基因的关键负调控因素。进一步研究发现BIN2的激酶活性在植物受冷胁迫早期会显著降低，而在后期回复至胁迫前的水平。这表明植物在感受到冷信号后，会通过某种机制抑制BIN2的作用，释放对ICE1的抑制作用从而诱导CBF基因表达，增强植物的耐低温能力；而在后期，BIN2的激酶活性恢复，防止过度响应对植物自身造成伤害。这项研究证明BIN2对ICE1的调控是植物冷响应过程的一个重要开关，对揭示植物应答低温胁迫的分子机制有重要意义。

基因表达调控模式图如下：

Figure 1.

Proposed Model of the Role of BIN2 in Modulating Cold-Stress Responses through Regulating ICE1 Stability in Arabidopsis.

原文题目：BIN2 negatively regulates ICE1 stability in response to cold stress in Arabidopsis （Plant Cell 2019年第11期）

反转发生在五个月后2020年4月

Plant Cell 最新研究否定了ICE1在植物冷胁迫过程中的作用

转录因子ICE1长期以来被认为是提高植物对冷胁迫耐受性的master regulator。来自冷环境的植物通常可以忍受非冷冻温度low nonfreezing temperatures的耐受性，被称为冷适应cold acclimation。CBF/DREB1 transcription factors是高等植物中保守的调控植物冷适应的转录因子。拟南芥基因组编码了三个CBF/DREB1 genes （CBF1/DREB1B, CBF2/DREB1C, and CBF3/DREB1A），它们在∼4°C条件下被快速诱导，同时诱导 CBF/DREB1-targeted COR (cold-regulated) genes，从而提高了freezing tolerance。Chinnusamy et al. (2003)发现 ICE1 (Inducer of CBF Expression1)可以正向诱导CBF3/DREB1A从而提高植物的 freezing tolerance。ICE1是一个MYC-like basic helix-loop-helix 转录因子。通过ice1突变体ICE1(R236H)（该突变体有一个236位的氨基酸替换R变H)的研究证实了该突变体抗冷性显著下降，同时CBF/DREB1基因表达下调。

2008年ICE1被认定为是一个调控植物气孔发育的一个基因。ICE1以及它的同源基因SCRM2/ICE2被证明可以通过与核心的气孔转录因子SPEECHLESS形成复合物来促进气孔的分化。  ice1-2 scrm2-1突变体中缺少气孔，这与spch mutant表型一致。功能获得性突变体scrm-D提高了气孔基因 EPF1的表达，形成了一种作者称之为“令人尖叫”“screaming”叶片表皮细胞，该表皮细胞充满了气孔。更为重要的是 scrm-D功能获得型突变体与之前的ice1突变部位和突变类型完全一致。叶片表皮细胞如下图：

 Kidokoro et al. (2020) 的研究challenge the thinking ICE1在调控CBF/DREB1 genes表达过程中的重要作用。

1. genetic analysis of the ice1-1 mutant：作者将 ice1-1 mutant与transgenic line carrying the emerald luciferase (ELUC) reporter fused to a portion of the CBF3/DREB1A promoter进行杂交，获得了1AR::ELUC  construct。F2代群体分析发现 the ice1-1/scrm-D 中气孔的增加与 EPF1的表达没有与 impaired cold induction of the 1AR::ELUC reporter or CBF3/DREB1A共分离. 而且转 ice1-1 gene并没有降低冷诱导的内源 CBF3/DREB1A 基因表达. 这些结果显示 ice1-1/scrm-D突变并不是导致CBF/DREB1A基因表达被抑制的原因，这与2003年的结果完全相反(Chinnusamy et al., 2003)。如果不是ice1-1/scrm-D，到底是什么引起了ice1-1/scrm-D突变体中CBF3/DREB1A表达被抑制呢？原因在于转基因引起的甲基化:在转 ice1-1基因中的植物中的 a CBF3/DREB1A::LUC transgene 引起了内源 CBF3/DREB1A的甲基化

Kidokoro et al. (2020)研究也存在 troublesome mystery. 2020年研究中用到的突变体 ice1-1(ABRC stock number CS67843)存在着 CBF3/DREB1A::LUC transgene，该片段转基因后位于哪个染色体片段的位置不清楚。而且这个片段CBF3/DREB1A::LUC transgene在原始的突变体 ice1-1中并不存在(ABRC stock number CS67845)。因此，2020年研究中的ice1-1突变体与2003年研究中的ice1-1突变体是不是一个突变体？

Nevertheless, the genetic analysis presented by Kidokoro et al. (2020), in conjunction with their ice1-1 transformation experiment, provides a compelling case that the ICE1(R236H) protein encoded by ice1-1/scrm-D does not impair the cold induction of CBF3/DREB1A.（但是无论如何作者确实发现了ICE1与CBF/DREB1 genes表达没有影响）

 wild-type ICE1对CBF/DREB1表达有没有影响？Kidokoro et al. (2020) 发现 ICE1 overexpression对3个CBF/DREB1 genes的冷诱导表达没有影响. 而且, null T-DNA insertion mutations ice1-2 and scrm2-1对任何的 CBF/DREB1基因表达均没有影响。ice1-2 scrm2-1 double mutation对 CBF1/DREB1B and CBF2/DREB1C表达也没有影响，只对CBF3/DREB1A有瞬时诱导.

Kidokoro et al. (2020) 的结果与诸多前人的结果相反：the results of Ding et al. (2015) and Kim et al. (2015) indicate that the ice1-2 mutation reduces peak cold induction of the CBF/DREB1 genes by 15 to 55%, depending on the gene and study. Also, whereas Kidokoro et al. (2020) found that overexpression of ICE1 had no effect on cold induction of the CBF/DREB1 genes, Miura et al. (2007) reported that ICE1 overexpression increased peak expression of CBF1/DREB1B and CBF3/DREB1A by ∼30% and CBF2/DREB1C by ∼2.4-fold. Moreover, the same group (Miura et al., 2011) further found that an ICE1(S403A) mutation that resulted in increased ICE1 protein stability at cold temperature also resulted in about a twofold increase in cold induction of CBF3/DREB1A.

为什么会出现截然相反的结果？ 答案也许很简单，就是CBF/DREB1基因的表达调控非常复杂. CBF/DREB1 genes 被 CAMTA1,2,3,5, CESTA, BZR1/BES1, and CCA1/LHY正向调控并且被MYB15, PIF3,4,7, EIN3, and SOC1负向调控. 而且影响CBF/DREB1表达的因素还包括temperature, light, phytohormones, development, the clock, photoperiod, mechanical stress, calcium flux。 因此ICE1对CBF/DREB1的调控的两种不同结果可能与不同批次实验有关，这里面既有样本本身的问题，也有环境因素的影响，ICE1和CBF/DREB1的调控关系是间接的而不是直接的）.

ICE1在冷胁迫中的功能到底如何？ICE1可以提高植物对冷胁迫的耐受性，但很可能不是通过CBF/DREB1来调控植物对冷胁迫的耐受性。另外，ICE1对气孔的影响也有可能是其调控植物冷胁迫的一个重要因素。17年前的研究确立了 ICE1-CBF-COR pathway在冷胁迫过程中的作用，而 Kidokoro et al. (2020)的研究实际上否定了ICE1-CBF-COR pathway。2003年的研究很有可能只是在某个条件下ice1突变体中CBF/DREB1被抑制，作者并没有通过酵母单杂交等方法证明ICE1直接调控CBF/DREB1的证据。因此ICE1如何调控下游基因的表达或者说ICE1下游真正的直接调控靶基因值得未来继续研究。

科学就是在否定别人的基础上向前行进的。