mRNA疫苗研究进展

作为mRNA疫苗mRNA vaccine概念的提出可以追溯到1989年。一般的疫苗是通过病原体本身或其中的一部分或免疫分子，注射机体，引起免疫反应来保护机体。而mRNA疫苗是将mRNA传递至细胞，表达产生蛋白，进而扩大机体的免疫能力。mRNA作为疫苗分子相对于DNA作为疫苗分子有如下一些优点：它不需要任何的核定位信号、转录及不可能整合到基因组，这避免了任何可能的治疗性突变。mRNA的使用也会带来一些问题，比如mRNA在生理条件下的不稳定性及引发不必要的免疫反应。单链或双链的RNA分子与模式识别受体相互作用，包括Toll样受体（toll-like receptors，TLRs）及视黄酸诱导基因蛋白I（retinoic acid inducible gene protein I，RIG-I），随之通过髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、β干扰素启动子刺激蛋白1（interferon-β promoter stimulator 1，IPS-I）等下游的信号通路蛋白来进一步激活免疫反应。mRNA自身的不稳定性及体内外广泛存在的RNA酶，mRNA疫苗的研究长期以来一直没有实质性的突破。近年来，由于mRNA合成技术、分子修饰技术及传递技术的发展，mRNA疫苗正逐步走向成熟，在肿瘤、感染性疾病等的防治上有着广泛的应用前景。

1、 mRNA疫苗的分子设计与化学修饰

真核生物的mRNA一般由如下元件组成：5’帽子结构、5’非翻译区（untranslated region，UTR）、开放阅读框（open reading frame，ORF）、3’非翻译区和1个大约100~250 bp 的多聚腺苷酸尾巴Poly（A）。mRNA疫苗的合成一般以含有靶蛋白开放阅读框的质粒DNA或其他DNA片段作为模板，通过体外转录技术合成而构成。由于mRNA在5’端含有帽子结构，3’端含有Poly（A）的结构，在体外转录合成mRNA后，一般需要加上这些元件。Rawai等发现使用抗反向帽子类似物（anti-reverse cap analogue，ARCA）能够避免帽子结构整合到mRNA的错误位置。使用其它帽子结构如加帽酶（capping enzyme,CE）及2-氧-甲基转移酶获得的帽子0（cap 0）及帽子1（cap 1）也显著的增强了mRNA的稳定性。另外，由于mRNA的高度不稳定性，研究者也往往通过增加一些其他不编码蛋白的区域及其他复合物来增加它的稳定性，如Zhao 等[9] 使用了2 个β珠蛋白（β-globin）非翻译区，大大地增强mRNA 的稳定性。最近报道了CureVac公司在不改变mRNA编码蛋白质序列的前提下改变了mRNA的其他序列，消除了部分核酸酶的酶切位点，使mRNA的稳定性提高了1万倍。近年来，使用化学修饰的方法体外合成mRNA以提高其稳定性和降低其免疫原性的报道开始出现。Karikó等[11]报道了使用不同的化学修饰核苷酸体外合成mRNA，发现使用100%假尿苷化学修饰的mRNA注射小鼠能显著地增强mRNA的转译效率及降低其免疫原性。Kormann等[12]报道了使用25%的5-甲基胞苷、25%的2-硫尿苷、化学修饰体外合成的mRNA，传递到人外周血单核细胞内，能显著地降低mRNA 结合到模式识别受体如TLR3、TLR7、TLR8及RIG-I 的机率，且表现出更低的免疫原性及更高的稳定性。Mays等使用10%的5-甲基胞苷、10%的2-硫尿苷，化学修饰体外合成的转录因子Foxp3 mRNA，传递到A549 细胞，能显著提高mRNA 的稳定性，表达的靶蛋白量也随之增大。Warren等使用了100%的5-甲基胞苷及假尿苷来化学修饰mRNA，然后将化学修饰的mRNA传递至不同的细胞。Uchida等使用了20%的5-甲基胞苷，10%的2-硫尿苷及10%的假尿苷来化学修饰mRNA注射小鼠。

2 、mRNA疫苗的传递

早期文献报道了阳离子脂质体、DEAE-右旋糖苷、多聚赖氨酸、树突状聚合物等各种物质应用于mRNA的传递[6]。使用电穿孔技术将mRNA传递至人类造血细胞以及胚胎干细胞可以达到50%~90%的转染效率。因为mRNA不需进入细胞核，只需使用较弱的电脉冲可以降低对细胞的毒性，另外使用电穿孔技术mRNA无需与模式识别受体结合，大大降低了mRNA传递造成的不必要的免疫反应。近年来广泛报道了使用TransIT-mRNA转染试剂应用于mRNA的传递，此试剂为非脂质体转染试剂，细胞毒性小，无明显的促细胞凋亡作用。使用TransIT-mRNA转染试剂包裹mRNA，肌肉内注射小鼠也显著提高了蛋白的表达。一些正链RNA病毒，甲病毒属（如辛德华斯病毒、福斯特病毒）、小核糖核酸病毒、黄病毒、仙台病毒等可用于mRNA的传递，这些病毒携带有靶蛋白的基因，它们的主要优点是只需进入细胞质，就可表达出所需要的蛋白。仙台病毒有一些突出的优点，它们没有基因毒性同时能感染各种类型的哺乳动物细胞或组织，而且也能被细胞膜内的神经氨酸所吸附而勿需通过内吞作用进入细胞，这样就避免了TLR信号的识别。但是，目前发现这些病毒载体可以导致细胞病变，这大大的限制了它们的使用。Su等[16]使用聚β氨基脂纳米颗粒（nanoparticles with a poly β-amino ester，PBAE）包裹磷脂双层用于mRNA传递树突状细胞，获得了较低的细胞毒性和相对较高的转染效率，这一方法其它的优点是对pH值敏感的PBAE 可以促进内含体的破坏。最近，Uchida等报道了使用聚乙二醇（PEG）-多聚氨基酸共聚物纳米胶束，来携带mRNA进入中枢神经系统。这种50 nm直径纳米胶束拥有包含mRNA的内核被PEG 包裹，提供了其高度的稳定性和传递mRNA的能力。使用这种方法能获得蛋白表达，也大大地降低了mRNA 的免疫原性。新的用于mRNA传递系统的包括金纳米颗粒偶联于DNA寡聚核苷酸（AuNP-DNA）。Brito 等使用MF59 阳离子乳液（cationic nanoemulsion, CNE）传递mRNA，检测到肌肉细胞内蛋白的表达效果类似于病毒载体。Walch Rückheim等[19]使用重组的非洲裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）传递DNA或mRNA至小鼠巨噬细胞及人类树突状细胞，诱导了靶蛋白的表达。

3、 mRNA疫苗用于肿瘤的防治研究

mRNA疫苗应用于抗肿瘤一般有2种策略，一是将mRNA传递至抗原提呈细胞即树突状细胞；一是直接传递mRNA至体内。Zhou等使用人工合成的人类黑色素瘤相关抗原gp100的mRNA与日本仙台病毒（Hemagglutinating virus of Japan，HVJ）脂质体包裹，然后直接注射至小鼠脾脏，诱导出了靶向gp100 的抗体及细胞毒性T 淋巴细胞的活性。Sebastian等[22]使用一种针对6种广泛表达于非小细胞性肺癌肿瘤抗原NY-ESO-1、MAGEC1、MAGEC2、5 T4、survivin 以及MUC1CV9202 的mRNA 疫苗，诱导出了显著的抗肿瘤免疫反应。Van Lint等将肿瘤抗原mRNA 与Trimix（CD40 及CD70 的mRNA 混合物）一起通过电穿孔技术传递小鼠树突状细胞，能够更为有效地诱导树突状细胞（dendritic cell，DC）的成熟。Fotin Mleczek等[24]使用双组分mRNA疫苗，一种是抗原mRNA如前列腺肿瘤特异性抗原，另一种为增强免疫刺激的TLR7配基蛋白的mRNA，免疫小鼠后，获得了持续的抗肿瘤免疫活性。双组分的mRNA疫苗具有辅助活性诱导持续的抗肿瘤活性，而且这种直接注射而引起的免疫应答反应迅速而剧烈，能够取得较好的疗效，为肿瘤患者的治疗争取更多的时间。Li等使用重组噬菌体MS2病毒类似颗粒（VLPs）包裹mRNA，在被巨噬细胞吞噬后12 h可检测到靶蛋白的表达，并随之诱导出抗前列腺肿瘤免疫活性，成功地延滞了肿瘤细胞的成长。迄今，mRNA疫苗已广泛应用于前列腺癌、急性骨髓白血病、转移黑色素瘤、成神经细胞瘤、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、脑癌等多种类型肿瘤的治疗研究。

4 、mRNA疫苗用于感染性疾病的防治研究

流感病毒表面有2种抗原血凝素（HA）和神经氨酸酶(NA)组成，Petsch等[8]最近报道将人工合成一段流感病毒H1N1血凝素蛋白的mRNA注入到小鼠皮肤里，在细胞内翻译出病毒蛋白后，进而诱导免疫反应保护小鼠免受流感病毒的感染。Pollard等使用阳离子脂质DOTAP/DOPE包裹Ⅰ型人类免疫缺陷病毒抗原Gag的mRNA，皮下免疫小鼠，诱导出了Ⅰ型干扰素的分泌，及抗原特异性的、功能性的T细胞反应。Zou 等使用人类天然免疫分子CAMP、S100A8/A9这2类天然免疫分子的mRNA来扩大口腔上皮细胞抵抗侵染性细菌的能力，发现抗菌肽CAMP（cathelicidin antimicrobial protein，CAMP）或钙卫蛋白S100A8/A9 mRNA转染后，均能独立地增强口腔上皮细胞抵抗李斯特菌或沙门氏菌侵染的能力。该工作的独特性在于传递天然免疫分子的mRNA而不是通过传递病原菌蛋白mRNA来诱导特异性的免疫反应。

5 、mRNA疫苗用于其它疾病的防治研究

Weiss等[27]使用mRNA疫苗在小鼠模型上针对Ⅰ型过敏反应的预防，能够有效阻止IgE引起的过敏性表型诱导，如过敏反应相关细胞因子的产生、嗜酸性粒细胞肺浸润、呼吸道高反应性等。Mays等]发现使用化学修饰的转录因子叉头状家族蛋白3（Forkhead/winged-helix protein 3, FOXP3）mRNA 传递鼠肺用于防止哮喘，发现化学修饰的FOXP3mRNA传递可以重新平衡肺部T辅助细胞反应、过敏原引起的组织炎症及其他过于强烈的呼吸道反应。机制上，FOXP3的诱导通过IL-10依赖的信号通路调节天然免疫细胞的募集进而影响Th2及Th17型炎症反应。

综上所述，mRNA疫苗技术发展非常迅速，且仍有宽广的发展空间。新的mRNA 疫苗的设计、mRNA传递技术的发展均可以影响到靶蛋白的表达及mRNA与模式识别受体的相互作用。直接将mRNA传递至细胞质可以增强靶蛋白的表达，避免与模式识别受体的结合也可大大减弱mRNA传递本身带来的免疫刺激。新的方法来增强mRNA靶向特异性的细胞类型也成为mRNA疫苗潜在的突破方向[29]。在mRNA 传递过程中包含一些附属的mRNA分子也可能成为获得更好免疫效果的突破方向。但是，这些可能的突破方向都会增加mRNA疫苗生产及处理方法的复杂性。而传统的免疫佐剂均能抑制mRNA疫苗蛋白的表达。从mRNA的本身特性、引发的免疫反应情况、大规模疫苗生产的有利条件等方面来看，mRNA疫苗具有其它疫苗无法比拟的优势。迄今，mRNA用于治疗的目的，还限制在癌症的免疫治疗中通过将mRNA转入树突状细胞方面。目前mRNA疫苗的研究主要聚焦于增强mRNA的稳定性、降低其免疫原性和发展新的传递技术，而将mRNA疫苗应用于不同类型疾病的防治研究也在不断的拓展。可以预计，新的高效、稳定的mRNA传递技术将成为mRNA疫苗应用于临床的关键。总之，mRNA疫苗的研究将在肿瘤及感染性疾病等的防治领域发展迅猛。