|
常用的凝胶物质及其特点 植物组培培养基中常用的凝胶物质有琼脂（Agar，由麒麟菜、石花菜、江蓠等藻类提取）和植物凝胶（Phytagel，由假单胞菌发酵提取）。结冷胶（Gellan gum）也是由微生物发酵而来，类似植物凝胶。 琼脂凝固性、稳定性好，凝胶呈半透明胶体状，单价低，是较理想的培养基凝固剂。以Coolaber的琼脂（CA1331）为例，组培培养基的添加量为6-7g/L。植物凝胶相对用量少，单位重量凝胶强度大于琼脂，凝胶透明度优于琼脂，单价高，随储存时间加长会逐渐变酸（由7减至5），相对保质期短（密封2年）。Coolaber的植物凝胶（CP8581Z），组培培养基的添加量为3-4g/L。琼脂、植物凝胶对酸性条件敏感，pH值低于5难以成胶或凝胶偏软，植物凝胶成胶对钙镁二价阳离子浓度有要求，琼脂则没有。 影响凝胶物质成胶的因素 1. 培养基的pH值偏低（且要考虑灭菌后培养基的pH值）； 2. 灭菌条件； 3. 钙镁二价阳离子的浓度； 4. 灭菌后凝胶物质分布不均； 5. 配好的培养基未及时灭菌； 6. 凝胶物质的加入量； 7. 凝胶物质的保质期。 配制植物组培培养基的注意事项 1. 务必考虑琼脂，尤其是植物凝胶对培养基pH值的影响。先调整pH值后加入琼脂，培养基pH值会下降0.1左右。而植物凝胶对pH影响就要看其新鲜程度，刚打开包装的植物凝胶会把培养基的pH值拉高0.5，甚至更高；保存时间较久的植物凝胶可将培养基pH值拉低0.5，甚至更低，这个是由其特性决定的，其自身pH值范围在5-7之间，且随保存时间延长而降低，对培养基pH值影响无规律可循。对于无需更换盛具的培养基建议添加凝胶物质后再调整pH值。如需分装后灭菌，需加入琼脂的，可将培养基其它部分pH值调高0.1，分装后加入琼脂；但对于需添加植物凝胶的培养基，则建议预先测定调整pH值所需加入酸碱的量，根据该值先行调整培养基其它部分的pH值，分装后再行逐一加入植物凝胶。切记！ 2. 高温高压灭菌会降低培养基的pH值。常规灭菌条件为115-121 ℃，15-30 min左右，Coolaber的实验结果（图1-3）说明，高温高压灭菌后培养基pH值会下降0.15-0.25，且灭菌温度越高，灭菌时间越长，pH下降值越大。培养基内的MS基盐含量越高，pH下降值越大。培养基内蔗糖含量对pH下降值影响不明显。一般推荐培养基pH值调至5.8-6.0，考虑高压灭菌对培养基pH值的影响，推荐灭菌条件115 ℃，20 min，或121 ℃，15 min。有条件的实验室也会采用过滤的方法除菌（凝胶物质后加入）。 3. 添加适当浓度的钙镁二价阳离子。Coolaber做过测试，不添加MS基盐的培养基（不含二价阳离子），植物凝胶不能成胶。因此减少MS等钙镁离子的基盐用量，务必要增加植物凝胶的用量，琼脂则不必考虑该问题。 4. 培养基灭菌后，冷却倒出前摇匀培养基。琼脂的密度大，培养基底层含量高，容易造成分布不均，使同一批灭菌培养基凝胶强度不一致。 5. 配好的培养基及时灭菌。Coolaber实验（图4）说明常温放置培养基3 h，pH值会下降0.35，时间越长下降越严重，24 h后会下降2.5左右，且MS基盐含量越低，缓冲能力越小，pH下降值越大。而4 ℃储存24 h，pH值下降幅度不大（＜0.05）。组培培养基配好后，应马上调整pH值，第一时间高压灭菌，如不能马上灭菌，务必最快速度放入冰箱暂存。 6. 不同品牌，或同品牌不同批次的凝胶产品的凝胶强度是有差异的。因此对凝胶强度要求较高的实验在选择产品后，甚至同品牌不同批次产品都应该预实验测试凝胶强度，以确定最佳添加量（同批号可免）。对于较幼嫩组织材料分化生根用培养基应适当减少凝胶物质的用量，以降低凝胶强度。 7. 妥善保存凝胶产品。凝胶产品应常温、干燥保存，避免阳光直射，对于绝大多数试剂来讲，密封保存都是最优先的选择。琼脂可以储存2-3年，植物凝胶打开包装后应尽快用完，未使用完的产品务必密封储存（不要超过2年）。 影响凝胶强度的因素 1. 培养基的pH值。Coolaber实验结果表明，不同初始pH值（灭菌后pH值下降幅度相当，见图1）的培养基凝胶强度表现为：pH6.3＞pH5.8＞pH5.3。pH值低于5则难以成胶。 2. 凝胶物质加入量。相同条件下凝胶加入量越大，凝胶强度越大。 3. 钙镁二价阳离子浓度。相同植物凝胶添加量的培养基凝胶强度：MS＞1/2MS＞1/4MS。琼脂无明显表现。 4. 凝胶物质的存放时间。长时间开口存放的植物凝胶成胶后凝胶强度明显下降。琼脂相应降幅较低。 5. 凝胶产品自身的凝胶强度指标。各品牌的指标不一，且标注混乱。以琼脂为例，浓度1.5%，pH7条件下凝胶强度900-1000 g/cm2，或浓度2%，pH7为1200-1300 g/cm2。而植物凝胶浓度0.5%，pH7，含二价阳离子的化合物浓度0.08%条件下，凝胶强度为900-1000 g/cm2。能达到上述指标的产品就是非常优质的产品。 结果与分析：不同初始pH值的MS培养基，不同灭菌条件下灭菌后pH值均明显下降，范围在0.1-0.25；灭菌温度越高或灭菌时间越长，pH下降值越大，但降幅不大（＜0.05）。 结果与分析：不同灭菌条件对培养基pH值下降的影响均与MS基盐的加入量相关，MS基盐越多，pH值下降越大；培养基pH值下降与MS含量相关性明显。 结果与分析：不同灭菌条件对不同蔗糖加入量的MS培养基的pH下降值均有明显影响，但不同蔗糖加入量与培养基pH下降值没有明显相关。 结果与分析：加入蔗糖后的，不同浓度MS基盐的培养基常温长时间放置pH值均下降明显，3 h下降0.35以上，放置时间越长，下降越严重；MS基盐加入量越低，缓冲能力减弱，培养基pH下降更为明显；未加入蔗糖的对照pH下降明显轻于加入蔗糖的培养基。4℃储存24 h，各种浓度MS培养基pH值降幅均不大（0.07-0.15）。 说明：MS基盐为Coolaber的PM1011，蔗糖为Coolaber的CS10581，pH计为梅特勒的FE28，灭菌器为滨江医疗的LS-150LD。 |
|
|
