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把多个样本混合在一起进行检测,节省时间和成本,可行吗?

2020-06-18  stingray9...
这个问题不好回答。请一直看到最后。


 
5.2  有关文库构建技术路线方面

什么是高通量测序?
高通量测序(high-throughput sequencing)并不是指一般意义上通量高的测序,而是特指二代测序(next generation sequencingNGS)NGS也翻译成下一代测序、新一代测序、平行测序。NGS一次反应能同时对数百亿个核酸分子进行测序(cluster密度高达数M/mm2),虽然测序长度(读长)比一代测序短,但是模板分子数(=平行进行的测序反应数)的增加幅度惊人,所以测序通量比一代测序提高了数千万倍,测序成本的降低速度超越摩尔定律。
由于数据量大规模提高,NGS使得对一个物种进行基因组分析和转录组分析成为现实;由于成本大规模降低,NGS使得临床和消费者基因检测应用变成了现实。
 
【云】一代测序与二代测序的要点比较如下:
技术               读长(bp)        模板数量        通量            增加倍数
一代测序        1000              96                 100k
二代测序        150-300        100M-20G     100M-6T    60M
 

什么是de novo测序?
de novo测序也叫从头测序,指一个物种第一次开展全基因组测序,其NGS数据的生物信息学数据分析由于没有现成的基因组参考序列(reference sequence)可用,算法比较特殊,难度也比较大。通常会组合运用多种测序方式,比如NGS,转录组测序(提供RNA剪接与可变转录本等信息),三代测序(长读长)等技术,数据相互参照,以取得高质量的组装图,因此成本也比较高。de novo测序的化学反应与标准NGS测序一样;但是其生物信息学数据分析算法不同,全基因组序列组装过程中不使用基因组参考序列,运算耗时较长。
随着NGS技术的发展,基因组测序所需成本和时间较传统技术大幅降低,越来越多的物种获得了全基因组序列。有了基因组参考序列后,对于同一物种其他个体的测序,其生物信息学数据分析就变得相对简单了,此种测序称为重测序。
 

什么是重测序(re-sequencing)?
重测序是对曾经进行过WGS测序、数据库中具有reference sequence的物种的不同个体进行测序。这种测序的化学反应部分与标准的NGS一样,但是生物信息学数据分析比de novo测序简单,依赖reference sequence进行全基因组组装,运算简单,速度快。
重测序可以应用于个体水平或群体水平的全基因组差异分析,解析与疾病、家系遗传、癌症发生、药效等有关的基因变异,研究其致病机理,寻找新的药物作用靶点,开发新药,筛选靶向药适用人群等。随着基因组测序成本的不断降低,人类疾病的致病突变研究由外显子区扩大到了全基因组范围,实现了在全基因组水平检测疾病关联的常见、低频甚至罕见的变异,具有重大的科研和产业价值。
 

什么是全基因组测序(whole genome sequencing, WGS)?
就是对整个基因组进行NGS测序,测序区域包括外显子、内含子以及基因之间区域,测序类型包括de novo sequencingre-sequencingWGS文库构建流程是所有NGS应用中最简单也是最基本的,其他技术方法都是在此基础上衍生发展出来的。
 

什么是外显子组测序(whole exome sequencing, WES)?
只对某一个基因组的全部外显子区域进行NGS测序,测序区域只包括外显子,有时还包括少量UTR区域,但是不包括内含子、不包括基因之间区域。这是因为有临床意义的基因变异主要发生在外显子区域,而外显子组只占基因组的2%左右,WES可以比WGS大幅度降低测序费用。

【云】WES文库的构建流程比WGS几乎复杂一倍。WES测序首先也要构建WGS文库,然后利用针对外显子区域的大量长探针进行大规模杂交,从WGS文库中把外显子片段捕获下来,再通过PCR进行扩增。Southern杂交的探针长度21 bp,而外显子捕获的探针可以长达120 bp,这是因为长探针比短探针具备更好的容错性,可以兼容各种未知的基因变异,从而在外显子文库中保留更多的基因变异信息。
靶基因区域比外显子组更小的靶向测序称为panel测序。Panel测序的基因数量可变,根据研究目的可多可少,少到1个基因,多到几千个基因。其中包括所有临床验证过的遗传病致病基因的panel,称为临床全外显子组测序(clinical exome sequencing, CES)
Panel测序与外显子组测序统称靶向测序。靶向测序都有一个靶基因捕获与富集的过程。捕获富集的方法主要有两种:探针杂交和多重PCR扩增。

WGSWES的区别见下表: 
技术                 靶区域大小      建库时间   数据量   测序深度  成本
WGS基因组      3G                     1          90G     30x         
WES外显子组   60M,小50     2.5      10G      150x       
 

什么是转录组测序(transcriptome sequencing,RNA-seq)?
转录组(transcriptome)指特定组织部位的细胞群、在特定时间点(即某一功能状态下)转录的全体RNA(包括mRNA和非编码RNA)的种类与拷贝数。研究人员仅需要一次试验,即可快速生成带poly-A尾巴的RNA的完整序列信息,分析基因表达、等位基因特异性表达、发现新的剪接异构体和罕见转录等转录组相关信息。
 
【云】转录组的内容主要体现在基因表达图式上,所以转录组与基因表达基本就是同义词。基因组主要体现在基因变异(包括多态性和突变)上,所以基因组与基因序列大致就是同义词。
与基因组相比,转录组的最大特色是:基因表达具有时间特异性和空间特异性。对于不同的组织样本,转录组不一样;即使是同一组织,它在不同的发育阶段和/或不同的生理状态下,其转录组也不一样。如果要研究RNA,样本种类多,不能互相取代。基因组就单纯多了,基本上全身一样、终生不变。除了肿瘤体细胞变异具有时间和空间特异性之外,基本上终生不变;除了生殖细胞是单倍体以外,基本上全身一样。这是因为基因自发发生变异的频率很低;所发生的变异当中,很大一部分又被机体自身修复了。如果研究基因组,不同类型的样本可用互相取代。除了癌组织与癌旁组织要严格区分,不可替代之外,研究遗传病的时候,外周血、唾液和新鲜冷冻组织等样本可以任取一种,其检测结果是基本一样的。
 

什么是small RNA测序?
你没有看错,小RNA (small RNA)就是指长度短、分子量小的RNA。小RNA种类繁多,比较常见的包括micro RNA (miRNA)siRNApiRNA等,它们调控基因表达、新陈代谢、细胞生长、个体发育、疾病发生等生理过程。在各种小RNA中,lncRNAmiRNA是比较有特色的两种,备受重视。
成熟的miRNA是长17~24 nt的单链非编码RNA,它通过与mRNA相互作用,影响目标mRNA的稳定性及翻译,最终诱导基因沉默或者被降解。
lncRNAlong noncoding RNA,长链非编码RNA)虽然号称长链,也属于小RNA,因为它只是相对于其他小RNA来说才比较长,与mRNA相比一点也不长。
 
RNA测序指对特定细胞、组织、或者体液样本中的全部small RNA进行深度测序并进行定量分析。
由于小RNA长度短,只需要进行1x50 bp的单端(single read)测序就足够了,可以节省成本。
small RNA测序有两种策略。一是先将长度在18-30 nt范围的small RNA从总RNA中分离出来,体外反转录成cDNA,然后在其两端加上通用接头,PCR扩增后测序。一是不分离small RNA,先加5’-接头,再加3’-接头,利用特别的酶的特性,只在天然带有3’-OH的小RNA的末端加接头,而人工打断的mRNA碎片不接,从而把小RNAmRNA区分开。
lncRNA测序也有两种策略。一是进行转录组测序,然后在数据分析过程中通过生物信息学的手段过滤去除mRNA数据,剩下的就是lncRNA数据。一是先用ribo-zero试剂去除样本中的rRNA,然后进行文库构建。由于rRNARNA样本的90%多,去除rRNA可以节省测序成本。
 
small RNA进行大规模测序,可以获得物种全基因组水平的miRNA图谱,实现未知miRNA分子的挖掘、小RNA作用靶基因的预测与鉴定、样品间miRNA表达差异分析、miRNA聚类和表达谱分析等目标。基于NGSmiRNA测序,一次实验即可获得数百万条miRNA序列,能够快速鉴定不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的miRNA的种类及其表达差异,为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力的工具。

 
什么是宏基因组(metagenome)测序?
宏基因组学(metagenomics)又称元基因组学、环境基因组学、生态基因组学,研究样本中的整个微生物群落,以直接从环境样本中提取的基因组遗传物质(即混合DNA)为样本,而无需进行细菌或其他微生物的分离、培养。相对于传统的单个细菌研究来说,它具有众多优势,其中最主要的有两点:(1) 微生物通常以群落方式共生于某一小生境中,它们的很多特性是基于整个群落环境及个体间的相互影响的,因此研究metagenomics比单个个体更能发现其特性;(2) Metagenomics研究无需分离单个细菌,可以研究那些不能被实验室分离培养的微生物。
 
【云】宏基因组测序神似鸟枪法。鸟枪法不用分离、克隆靶基因,宏基因组测序不用分离、培养目标微生物。二者都能提高工作效率。
与单一样本检测相比,混合样本的检测要求技术方法、试剂盒的灵敏度更高。NGS可用做宏基因组测序,一代测序和PCR就不行,正如NGS可以做NIPT,一代测序和PCR就不行一样。
混合样本检测可用提高效率,节省成本,那是以先进技术为代价的。没有金刚钻,混样需慎重!

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