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生物下游纯化产品及解决方案 1 蛋白纯化 蛋白质的分离纯化是用生物工程下游技术从混合物之当中分离纯化出所需要的目的蛋白质的方法。 随着生物技术的发展，越来越多的蛋白质及多肽链通过基因工程、蛋白质工程以及发酵工程等生物技术的运用被设计、制造及生产出来。一个典型的真核细胞可以包含数以千计的不同蛋白质，一些含量十分丰富，一些仅含有几个拷贝。为了研究应用某一个蛋白质，必须首先将目的蛋白质从混合的蛋白质分子和非一些蛋白质分子中分离出来。因此，重组蛋白的分离纯化在生物化学研究应用中使用广泛，是一项重要的操作技术。 2 蛋白质分离纯化的一般步骤 蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤： 图1 从组织细胞中进行蛋白分离流程图 2.1材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，需要根据蛋白表达的方式对其进行预处理。例如，对于胞内表达的蛋白，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法见下表1： 表1 常用的破碎细胞方法
2.2蛋白质的抽提 在蛋白质的抽提过程中，通常选择适当的溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液溶剂的组成成分、pH、离子强度等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100 等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。细胞碎片等不溶物可用离心或过滤的方法除去。 2.3蛋白质粗制品的获得 当获得蛋白质提取液后，可选用适当的方法，将目的蛋白与其他杂蛋白分离。一般这一步的分离可用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。这些方法的特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白溶液。若蛋白提取液体积较大，又不适于用沉淀或盐析法浓缩，则可采用超过滤、凝胶过滤、冷冻真空干燥或其他方法进行浓缩。常用的有下列几种方法： ① 等电点沉淀法 不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。 ② 盐析法 盐析是指在蛋白质水溶液中加入中性盐，随着盐浓度增大而使蛋白质沉淀出来的现象。盐析是依据蛋白质溶解度不同进行分离的技术。中性盐是强电解质，溶解度又大，在蛋白质溶液中，一方面与蛋白质争夺水分子，破坏蛋白质胶体颗粒表面的水膜；另一方面又大量中和蛋白质颗粒上的电荷，从而使水中蛋白质颗粒积聚而沉淀析出。常用的中性盐有硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，但以硫酸铵为最多。盐析得到的蛋白质一般不失活，一定条件下又可重新溶解，因此这种沉淀蛋白质的方法在分离、浓缩，贮存、纯化蛋白质的工作中应用极广。 盐析法的优点在于不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的目的蛋白质。 ③ 有机溶剂沉淀法 中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。 3 样品的进一步分离纯化 用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。 有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。 常见蛋白分离纯化技术的介绍 蛋白质分离主要根据五种原理:分子大小、溶解度、电荷、吸附性质、对配体分子的生物学亲和力等。例如盐析、凝胶过滤法、离子交换层析、疏水作用层析、亲和层析及反相层析等。 图2 常见5种蛋白质分离方法 1 凝胶过滤 凝胶过滤层析法又称为排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离，大分子物质被排除在外部，流下路程短，先流出来，而小分子物质能进入层析填料的内部，流下时路程较长，因此会后流出来，如图2所示。 图3 凝胶层析的原理 凝胶过滤层析的突出优点是层析所用的填料属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。 2 离子交换层析 离子交换层析分离根据是蛋白质的等电点不同，当蛋白质处于不同的pH条件下，蛋白质所带电荷不同而进行的分离方法。离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。常用于蛋白质分离的离子交换剂有弱酸型的羧甲基纤维素(CM纤维素)和弱碱型的二乙基氨基乙基纤维素(DEAE纤维素)。前者为阳离子交换剂，后者为阴离子交换剂。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。离子交换层析是低盐上样，高盐的条件可进行洗脱的。其基本流程如图3所示。 图4 离子交换层析的基本流程 离子交换层析属于吸附性分离方式，纯化过程中它具有可逆、操控性强及实现样品浓缩等特点。在精纯实验中是常与其它方法相结合使用的主要技术。 3 疏水作用层析 疏水层析也称疏水作用下层析，从分离纯化机制来看，也属于吸附层析一类。疏水层析是利用固定相载体上偶联的疏水性配基与流动相中的一些疏水分子发生可逆性结合而进行分离。 蛋白质表面一般有疏水与亲水基团，疏水层析是利用蛋白质表面某一部分具有疏水性，与带有疏水性的载体在高盐浓度时结合。在洗脱时，将盐浓度逐渐降低，因其疏水性不同而逐个地先后被洗脱而纯化，可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。 该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则没有此种性质，利用此种性质，可以将蛋白质初步的分离，用于盐析之后的蛋白质进一步提纯。一般而言，离子强度（盐浓度）越高，物质所形成的疏水键越强。影响疏水作用的因素包括：盐浓度，温度，pH，表面活化剂和有机溶剂。疏水层析的应用与离子交换层析的应用刚好互补，因此，可以用于分离离子交换层析很难或不能分离的物质。 4 亲和层析 亲和层析是一种利用生物分子之间的特异性相互作用来分离分子的色谱方法。亲和层析在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和层析可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。 将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。其基本流程如图4所示。 图4 亲和层析的基本流程 亲和层析具有高选择性、高纯度、快速、浓缩等特点，在重组蛋白的分离中多作为第一步的粗纯，实现对绝大部分杂质蛋白的去除。 5 反相层析 反相层析(RPC)是指利用非极性的反相介质为固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行溶质分离与纯化的洗脱色谱法。与疏水层析一样，反相层析中溶质也通过疏水性相互作用分配于固定相表面，但是，反相层析固定相表面完全被非极性基团所覆盖，表现出强烈的疏水性。因此，必须用极性有机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液进行溶质的洗脱分离。 溶质在反相介质上的分配系数取决于溶质的疏水性，一般疏水性越大，分配系数越大。当固定相一定时，可以通过调节流动相的组成调整溶质的分配系数。反相层析主要应用于相对分子质量低于5000，特别是1000以下的非极性小分子物质的分析和纯化，也可以用于蛋白质等生物大分子的分析和纯化。由于反相介质表面为强烈疏水性，并且流动相为低极性的有机溶剂，生物活性大分子在反相层析分离过程中容易变性失活，所以，以回收生物活性蛋白质为目的时，应注意选用适宜的反相介质。 反相介质的商品种类繁多，其中最具代表性的是以硅胶为载体，通过表面键合非极性分子层制备。通过控制反应时间和温度，可获得性能稳定的反相介质。在硅胶基质的反相填料中，以键合有C18、C8、C2的球形多孔填料最为常见，用途最广。 反相层析固定相大多是硅胶表面键合疏水基团，基于样品中的不同组分和疏水基团之间疏水作用的不同而分离。在生物大分子分离中，多采用离子强度较低的酸性水溶液，添加一定量乙腈、异丙醇或甲醇等与水互溶的有机溶剂作为流动相。 4 结语 蛋白质的分离纯化技术作为发酵后处理中关键的一步，操作的合理性直接影响产物最后的产率，对企业生产成本，利润直接挂钩，熟练的掌握蛋白质分离纯化技术，并利用合理的方式在保证产量的基础上提高纯度是发酵后处理值得研究的永恒课题。   杭州九龄公司简介：公司是专注于生物制药与细胞培养、澄清、过滤、浓缩脱盐、内毒素去除的开发生产公司；产品广泛用于医药、疫苗、诊断、血液制品、食品、饮料及工业流体的过滤、检测、澄清、纯化与浓缩过程；九龄成功开发出超滤管、内毒素去除滤芯、微滤&超滤膜包与切向流过滤装置、无菌下磁力搅match拌器及相关产品，完全满足生物制药、细胞培养等的应用需求。  我们的膜与膜过滤器广泛应用于预过滤、微滤、超滤、纳滤的浓缩、提取及分离；我们众多产品生产线， 从小型一次性实验室过滤到生产型过滤系统、无菌搅拌、无菌检测、发酵、细胞培养、储存及灌装等，一 定能找到您所需的应用产品。 我们将持续在研发上加大投入，追求创新，以开发新产品与先进的分离技术；九龄公司的膜专家、技术工 程师与质量管理团队会始终关注您的分离应用需求，并提供一流的技术服务；我们的产品小组可随时与我 们的客户就特殊项目进行合作，通过我们经销网络及物流，可向全球客户供应我们优质的产品。 |
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