16S rRNA基因测序

什么是16S rRNA？
16S rRNA是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分，长度约为1542nt，具有高度的保守性和特异性。16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。16S rRNA基因包括保守区和可变区，保守区反映了物种间的亲缘关系，而可变区则反映了物种间的差异。16S rRNA基因测序一般是利用MiSeq对16S rRNA基因的V3-V4可变区进行测序，以此来研究微生物多样性。

image.png

Fadrosh等采用改善的双端index方法对V3-V4进行测序：

image.png

16S rRNA基因测序一般包括基因组DNA提取，目的片段PCR扩增及文库构建，测序，生物信息分析等步骤。常用的生物信息分析软件主要是QIIME，这是一款16S分析神器，包括OTU聚类及多样性等多种分析，而且还有详细的文档说明。
16S rRNA基因测序常见名词解释：
OTU：(operational taxonomic unit)，即操作分类单元，通过相似性对个体进行分组，根据序列彼此的相似性进行聚类，然后基于设置的相似性阈值（通常为97％相似性）来定义OTU，简而言之，每个OTU代表一种16S rRNA，所以一个OTU对应于一个物种。通过OTU分析就可以知道样品中的微生物多样性和丰度。
Alpha多样性：即一个样品内的微生物多样性，常见的度量指标有Chao1 richness estimator，Shannon diversity index和Simpson diversity index等。
Beta多样性：即不同样品间的微生物多样性，衡量不同样品之间的差别。
稀释曲线：从样品中抽取一定数量的reads，统计这些reads所代表的OTU。稀释曲线可以用来衡量测序数据量是否合理，并间接反映样品中物种的丰富程度。