分子克隆的正确打开方式 | 质粒构建之引物设计（三）

    前几日我们推出了质粒转化的基本操作问题，那么质粒的引物是怎样设计的呢？今天我们来唠一唠这个问题。

    基因敲除通过降解具有同源序列靶基因的mRNA，达到阻止基因表达的作用。短发卡RNA (shRNA) 是可以克隆到表达载体并表达短的干扰RNA的DNA分子。我们可根据靶基因设计短发卡RNA (shRNA)序列并将其克隆到特定载体上。根据不同的载体，又可以进行常规质粒构建与慢病毒质粒构建。

ShRNA的设计原则

1

克隆到ShRNA表达载体中的ShRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制,常用的茎环序列有5-CTCGAT-3;随后在连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。5-6个T必须放置在ShRNA插入片段尾部以确保RNA聚合酶III终止转录。

2

两个互补短反向重复序列两端须带有限制性酶切位点。  

3

在正义链和反义链序列上不能出现连续3个或以上的T。这可能导致ShRNA转录的提前终止。

ShRNA两个短反向重复序可以通过网站进行设计，但是shRNA的效率无法判断。目前最快捷有效的方式可以通过Sigma官方网站进行查找，还可以查看序列的有效敲除效率。

       

1

进入Sigma官网，http://www./china-mainland.html。点击产品，进入生命科学中的功能基因组学&RNAi，点击进入。

2

进入网页后点击进入shRNA

3

点击search for shrna clones，在对话框内输入需要查找的基因名称

4

进入网页后，可以看到基因DicerI下面包含多种产品，在products后寻找到shrna panels，点击进入

5

进入之后选择plasmid DNA后的价格

6

下面就是DicerI 的shRNA序列，同时带有validated标志的序列优先选择，是有效序列，敲减效率在图中也可查看。

7

下面获得shRNA序列

CCGGGCTGGGATGATGGTAAGAGAACTCGAGTTCTCTTACCATCATCCCAGCTTTTTG

得到shRNA序列之后，下一步我们就要考虑选择质粒酶切位点啦，然后根据不同的连接方式处理shRNA，使之含有相应的酶切位点，进而与质粒载体相连接，下期为大家介绍~