质粒构建详尽版（二）

实验步骤

质粒构建及鉴定

扩

1.使用设计好的引物进行

（使用准备好的模板，模板尽量选择目的基因高表达的细胞或组织，模板的制备具体涉及到RNA的提取、cDNA的反转录等实验过程，这些方面此处不加赘述，如采用成品的试剂盒，则具体实验过程参照说明书即可，如果是经典的实验方法则具体的实验步骤可在网上查询或留言；根据设计引物时的Tm值及GC含量等参数，设置PCR条件，退火温度先以低于Tm值3-5℃为宜，此处Tm值指的是包含保护碱基和酶切位点在内的全序列，因为理论上在PCR的第3个循环即有一半的模板为全序列互补的，如有必要可设置退火温度的梯度进行优化）

胶

2. PCR产物琼脂糖凝胶电泳

（最好在PCR时设置无模板对照（NTC），跑胶时有利于确定引物二聚体的位置，同时也有利于辨别特异性扩增的条带；将上述PCR产物全部（可根据目的基因的表达情况调整用量）加入琼脂糖凝胶的上样孔，琼脂糖凝胶一般选择1%即可，跑胶电压100V，30min左右即可）

收

3. 切胶回收

（将上述跑好的琼脂糖凝胶放置于凝胶成像仪紫外灯下，参照NTC组和目的片段的理论大小确定目的条带，PCR扩增难免会有非特异扩增的产物条带，理论上你的目的条带应该是最亮的，如此可直接进入下一步实验；否则就要在引物设计和PCR条件上找原因了，一般只要目的片段理论大小的位置有条带尽管不是最亮的，而NTC在该位置没有条带，同样也可以进入下一步实验；凝胶回收的实验一般均采用成品试剂盒，如国产的天根和进口的Axygen等均可，具体实验步骤按说明书进行即可；对于凝胶回收，4℃放置过夜溶胶会比直接按试剂盒中高温水浴快速溶解回收效果好，对于回收效率极低的情况可以尝试）

切

4.双酶切克隆产物和空载

（胶回收后PCR产物和空载体同时分别进行双酶切，双酶切体系可参考限制性内切酶的商家说明书，如NEB或TaKaRa，需要注意的是内切酶都有对应的反应Buffer，如果使用不合适可产生型号活性，所以在酶切位点选择是也要参考这方面的因素进行综合选择，如下为TaKaRa给出的双酶切内切酶配对Buffer表（部分），如要完整表单可在TaKaRa官网下载或留言）

收

5.酶切产物的回收

（此处胶回收的流程同前，在进行凝胶电泳时需注意，最好同时将未进行酶切的质粒空载同时进行跑胶比较，理论上环状质粒（未酶切）比线性质粒（经过酶切）跑的快，因为质粒分子量一般都比较大（>2kb），所以电泳时可多跑几分钟使得这样的差异尽可能扩大，易于比较观察，以充分确定酶切有效。）

连

6.酶切产物的连接

（连接体系一般为10-25ul，16℃连接过夜（有部分商业化的试剂盒可16℃连接30min即可），金属浴和PCR仪均可，不建议使用水浴，温度不稳定。）

转

7.质粒转化

（根据实验目的选用合适的感受态细胞，如后续要提取质粒进行下游转染或其他实验，采用DH5α感受态细胞即可，如果后续需要大量表达插入基因的目的蛋白，则采用BL21感受态细胞即可，不同感受态细胞的功能不同，需注意区分；转化采用热激法，冰上30min使质粒附着于感受态细胞表面，然后42℃ 90s热激使质粒进入细胞内，切记时间不可过长，然后在立即置于冰上5min左右。）

摇

8. 转化后摇菌

（转化后的菌液于超净工作台中加1ml LB培养基，然后置于摇床37℃摇菌，一般转速为120-150转/min，时间一般为45-60min。）

养

9. 涂板培养

（摇菌后的菌液在超净工作台中在预先准备好的平板上进行涂板，需要注意的是：A平板配置时加入的抗生素需与转化的质粒的抗生素抗性匹配；B平板可以在涂板前30-60min放于37℃培养箱预热，一方面有利于涂板后菌落的生长，另一方面有利于蒸发掉刚从冰箱中拿出的平板上的水蒸气；C涂板时建议少量使用菌液，可结合此前胶回收的条带亮度考虑，一般取几十微升涂板即可，且最好采用化波浪线的涂板方式，以防止菌落连成片而无法挑取单克隆。）

挑

10.挑克隆及PCR鉴定

（一般挑取3-5个单克隆即可，克隆挑取尽量选择大小均匀（不要太大也不要太小）的单克隆；如后续要经过PCR鉴定且基因较难克隆可以挑取10个左右经过PCR鉴定筛选；PCR鉴定理论上可以使用克隆引物进行鉴定，但最好设计专门的鉴定引物（如有后续做qPCR的定量引物可直接使用），更严格一点也可采用上游的鉴定引物（目的序列上）和测序用通用引物下游引物（载体序列上）进行搭配使用鉴定；PCR鉴定时严格设置对照组，且尽量降低PCR循环数25左右为宜，不可太高，否则很可能会有假阳性结果出现。）

测

11.测序

（一代测序服务的公司比较多，像南京金斯瑞、上海生工等均提供该服务，价格一般为16-20元/反应，一般一个反应可测到1kb左右的序列长度，除去引物端序列和末尾的100bp左右的序列存在测序不准确的情况，一个反应可以测出大约800bp准确的序列，如果目的片段<800bp，测1个反应即可；如果在800-1600bp之间可正反向各测1个反应即可；如果>1600bp，则最少需要测3个反应，中间至少需要设计一次walking引物，测序公司会自己设计合成，你只需要承担费用即可。）

质粒构建实验流程

方案归纳

整体的质粒构建实验在时间安排上可以分两种方案：1）第一天，RNA提取需1h，cDNA反转录需0.5h，PCR需至少1.5h，两次胶回收需要2h，双酶切需要1h，以上共计6h，加上中间操作过程及休息时间，一般到连接时已经晚上，适合过夜连接；第二天，早上转化摇菌涂板，一般晚上即可看到克隆长出，可挑克隆于LB培养基过夜培养；第三天，早上把过夜培养变浑的菌液取适量进行PCR鉴定，经定时要严格设计无模板对照，且PCR循环数在25左右为宜，最好不要太高，最后PCR阳性的菌液送去一代测序即可；也可不用做PCR鉴定，直接将变浑浊的菌液都送去测序即可。2）第一天，进行到涂板后过夜培养（这种情况可采用30min的连接，共需要9h纯实验时间，会晚一点，亦或者是采用之前提取好的RNA或反转录好的cDNA进行实验会比较合适）；第二天，早上挑克隆，LB培养基中摇菌培养，一般半天的时间即可看到菌液浑浊，下午即可送样测序。此方案时间可缩短1天。

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