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质粒构建详尽版(一)

2020-07-05  演戲599

质粒构建详尽版(一)

基本原理

分、切、连、转、筛

分离出要克隆的目的基因及载体。

用限制性内切酶切割目的基因和载体,使其产生便于连接的末端。限制性内切酶:是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性核酸内切酶根据识别切割特性,催化条件及是否具有修饰酶活性分为三大类。其中型酶能识别双链DNA的特异顺序,并在这个顺序内切割,产生特异性DNA片段,是DNA重组技术中常用的酶。型酶:具有修饰和切割功能,无固定切割位点型酶与型类似,能识别特异位点,但切割位点在识别位点以外型酶特点:识别顺序一般为46个碱基对识别顺序具有180度的旋转对称性,呈完全的回文结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割,可产生两种不同末端:平末端,粘末端平末端:在识别顺序的对称轴上,对DNA同时切割形成平末端,如:SmaI  5’CCC GGG3’                           5’CCC           GGG3’3’GGG CCC5’                           3’GGG           CCC5’5′突出粘末端:在识别序列的两侧末端切割DNA双链,于对称轴的5 ′末端切割产生5 ′端突出的粘性末端,如:Hind Ⅲ 5’―AAGCTT―3’                          5’― A               5’AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’                          3’― TTCGA5’               A―5’3′突出粘末端:5′突出粘末端作用相反,产生3 ′端突出粘末端,如:PstI5’―CTGCAG―3’                          5’―CTGCA3’               G―3’3’―GACGTC―5’                          3’―G               3’ACGTC―5’命名:酶来源的生物名称缩写属名-种名-株名-发现次序根据其来源命名。如:EcoRI来源于大肠杆菌E.coliRY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶活单位定义:在适当的条件下(TpH,离子强度等)一小时内完全酶解1ug特定DNA底物所需要的限制性核酸内切酶的量,定义为1个活性单位。目前常用的酶单位的定义是:37℃ 1小时内50ul反应体系完全酶解1ugλ DNA所需的酶量。在建立酶切体系时,酶的用量一般为15U/ugDNA

将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接。来源:T4DNA连接酶是T4噬菌体基因30编码的产物。最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。分子量为68KD,。最佳pH7.2-7.8,常用的反应液为pH7.6TrisHcl需要ATP作为辅助因子并由ATP提供能量④DTT等巯基化合物可促进连接酶的连接作用高浓度的钠、钾离子等抑制酶活性

把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程(细菌:E.coli,真菌:Yeast,昆虫细胞或哺乳动物细胞)。

在不同层次上、不同水平上进行筛选,鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法,将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如:载体大小,酶切结果,筛选标记等。

操作步骤

之  克隆引物的设计




1.确定需要构入质粒载体目的片段,如要克隆某个基因,如KRAS,可在NCBI上查找其CDS序列,如下:

 

NCBI中选择Gene,输入基因名称搜索,在下方可见第一个即为人源的KRAS基因,如有其他物种需求,可在下方寻找,或直接在搜索框中加入物种名称即可)

2. 点入查找出的基因,下拉至如图位置可见多个基因亚型(部分基因无):

(如KRAS基因,共有四个亚型a/b/c/d,一般选择最长的亚型(除有特殊需求),一般为第一个,也有基因亚型下方的描述中会标明该亚型为最长的亚型,或者可点进mRNA(如上为NM_001369786.1 )依次查看序列长度,找好最长的基因亚型,点进其mRNA信息)


3. 查找CDS区,如下:

(下拉到CDS区,如上所示可以看到明显的CDS区为178-747,下方还可以看到翻译后的氨基酸序列)

4. 再在该页面拉回到最顶部,查看完整的序列信息:

(点击上方的FASTA即可看到如上所示的mRNA序列信息,在右侧的Change region shown选择Selected region,然后填入上一步查找的CDS区位置,点击Update view即可,如下图即为KRASCDS区序列,ATG为起始密码子,TAA为中止密码子


5. 根据CDS区序列信息设计克隆引物,克隆引物包括如下几个部分:

(保护碱基、酶切位点、与目的序列互补配对的区域,也有人在上游引物的酶切位点后加TCCACC或只加ACC用来增加质粒转染后的转录效率,笔者为比较过添加与否有何差异;注意:A保护碱基和酶切位点有现成的配套表(如下图所示),可在网上查找或留言;B酶切位点选择为两个不同的酶切位点分别放置于上下游引物,且酶切位点的选择需参考要构入的目标载体的多克隆位点区域,同时最好选择较常用的酶切位点,如EcoRI/Hind III等,且不得在目的序列中含有;C载体的选择需要考虑是否携带融合标签,如HA/Flag/GST等;D如载体标签在N端,则上游引物的设计需要考虑移码突变的问题,如果载体标签在C端,则下游引物设计需要考虑不要加中止密码子;E其他引物设计方面同一般引物的设计,如GC含量、Tm值、互补区段长度等,此处不加赘述,后续针对引物设计会单独进行分享)

如:Hind Ⅲ 5’―AAGCTT―3’           酶切后:    5’― A               5’AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’                          3’― TTCGA5’               A―5’

敬请期待《质粒构建详尽版(二)》


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