质粒构建详尽版（一）

质粒构建详尽版（一）

基本原理

分、切、连、转、筛

分

分离出要克隆的目的基因及载体。

切

用限制性内切酶切割目的基因和载体，使其产生便于连接的末端。限制性内切酶：是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。限制性核酸内切酶根据识别切割特性，催化条件及是否具有修饰酶活性分为三大类。其中Ⅱ型酶能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内切割，产生特异性DNA片段，是DNA重组技术中常用的酶。Ⅰ型酶：具有修饰和切割功能，无固定切割位点Ⅲ型酶与Ⅰ型类似，能识别特异位点，但切割位点在识别位点以外Ⅱ型酶特点：①识别顺序一般为4－6个碱基对②识别顺序具有180度的旋转对称性，呈完全的回文结构③Ⅱ型酶对双链DNA两条链同时切割，可产生两种不同末端：平末端，粘末端平末端：在识别顺序的对称轴上，对DNA同时切割形成平末端，如：SmaI  5’－CCC GGG－3’                           5’－CCC           GGG－3’3’－GGG CCC－5’                           3’－GGG           CCC－5’5′突出粘末端：在识别序列的两侧末端切割DNA双链，于对称轴的5 ′末端切割产生5 ′端突出的粘性末端，如：Hind Ⅲ 5’―AAGCTT―3’                          5’― A               5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’                          3’― TTCGA－5’               A―5’3′突出粘末端:与5′突出粘末端作用相反，产生3 ′端突出粘末端，如：PstI5’―CTGCAG―3’                          5’―CTGCA－3’               G―3’3’―GACGTC―5’                          3’―G               3’－ACGTC―5’命名：酶来源的生物名称缩写属名-种名-株名-发现次序根据其来源命名。如：EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶活单位定义：在适当的条件下（T，pH，离子强度等）一小时内完全酶解1ug特定DNA底物所需要的限制性核酸内切酶的量，定义为1个活性单位。目前常用的酶单位的定义是：37℃ ，1小时内50ul反应体系完全酶解1ugλ DNA所需的酶量。在建立酶切体系时，酶的用量一般为1－5U/ugDNA。

连

将切割后的目的基因和载体用T4DNA连接酶连接。①来源：T4DNA连接酶是T4噬菌体基因30编码的产物。最早是从T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的。分子量为68KD，。②最佳pH7.2-7.8，常用的反应液为pH7.6的Tris－Hcl③需要ATP作为辅助因子并由ATP提供能量④DTT等巯基化合物可促进连接酶的连接作用⑤高浓度的钠、钾离子等抑制酶活性

转

把连接好的重组载体转化入感受态细胞的过程（细菌：E.coli，真菌：Yeast，昆虫细胞或哺乳动物细胞）。

筛

在不同层次上、不同水平上进行筛选，鉴定所需的特异性重组子。使用各种方法，将带有重组载体的宿主菌从培养基中筛选出来。例如：载体大小，酶切结果，筛选标记等。

操作步骤

之  克隆引物的设计

1.确定需要构入质粒载体目的片段，如要克隆某个基因，如KRAS，可在NCBI上查找其CDS序列，如下：

 

（NCBI中选择Gene，输入基因名称搜索，在下方可见第一个即为人源的KRAS基因，如有其他物种需求，可在下方寻找，或直接在搜索框中加入物种名称即可）

2. 点入查找出的基因，下拉至如图位置可见多个基因亚型（部分基因无）:

（如KRAS基因，共有四个亚型a/b/c/d，一般选择最长的亚型（除有特殊需求），一般为第一个，也有基因亚型下方的描述中会标明该亚型为最长的亚型，或者可点进mRNA（如上为NM_001369786.1 ）依次查看序列长度，找好最长的基因亚型，点进其mRNA信息）

3. 查找CDS区，如下：

（下拉到CDS区，如上所示可以看到明显的CDS区为178-747，下方还可以看到翻译后的氨基酸序列）

4. 再在该页面拉回到最顶部，查看完整的序列信息：

（点击上方的FASTA即可看到如上所示的mRNA序列信息，在右侧的Change region shown选择Selected region，然后填入上一步查找的CDS区位置，点击Update view即可，如下图即为KRAS的CDS区序列，ATG为起始密码子，TAA为中止密码子）

5. 根据CDS区序列信息设计克隆引物，克隆引物包括如下几个部分：

（保护碱基、酶切位点、与目的序列互补配对的区域，也有人在上游引物的酶切位点后加TCCACC或只加ACC用来增加质粒转染后的转录效率，笔者为比较过添加与否有何差异；注意：A保护碱基和酶切位点有现成的配套表（如下图所示），可在网上查找或留言；B酶切位点选择为两个不同的酶切位点分别放置于上下游引物，且酶切位点的选择需参考要构入的目标载体的多克隆位点区域，同时最好选择较常用的酶切位点，如EcoRI/Hind III等，且不得在目的序列中含有；C载体的选择需要考虑是否携带融合标签，如HA/Flag/GST等；D如载体标签在N端，则上游引物的设计需要考虑移码突变的问题，如果载体标签在C端，则下游引物设计需要考虑不要加中止密码子；E其他引物设计方面同一般引物的设计，如GC含量、Tm值、互补区段长度等，此处不加赘述，后续针对引物设计会单独进行分享）

如：Hind Ⅲ 5’―AAGCTT―3’           酶切后：    5’― A               5’－AGCTT―3’3’―TTCGAA―5’                          3’― TTCGA－5’               A―5’

敬请期待《质粒构建详尽版（二）》

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